RGD-重組蛛絲蛋白作為新型生物敷料的研究.pdf

1、蜘蛛絲是一類具有優(yōu)越力學(xué)性能如具有高度的張力和彈力的天然生物材料，同時(shí)天然蜘蛛絲具有良好的生物相容性，在生物醫(yī)學(xué)領(lǐng)域有著廣闊的應(yīng)用領(lǐng)域。本文對(duì)RGD一重組蛛絲蛋白工程菌pNS16/BL21(DE3)pLysS和pNS32/BL21(DE3)pLysS的高密度發(fā)酵工藝進(jìn)行優(yōu)化，進(jìn)行重組蛛絲蛋白純化，所獲得的重組蛛絲蛋白用于制備重組蛛絲蛋白膜材料，SD大鼠體內(nèi)植入實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證了其生物相容性，并首次嘗試將該材料作為一種新型的生物敷料運(yùn)用于SD大鼠

2、深Ⅱ度皮膚燙傷修復(fù)。 首先研究了誘導(dǎo)前菌體密度，誘導(dǎo)時(shí)添加Gly/Ala濃度，誘導(dǎo)后菌體培養(yǎng)溫度三個(gè)因素對(duì)RGD-重組蛛絲蛋白工程菌高密度發(fā)酵目的蛋白表達(dá)的影響。通過(guò)優(yōu)化實(shí)驗(yàn)與重復(fù)實(shí)驗(yàn)，確立pNSR16/BL21(DE3)pLysS獲得較高表達(dá)水平的綜合條件為：誘導(dǎo)時(shí)菌體OD600m=30，溫度30℃，0.2％(w/v)的Gly/Ala濃度；pNSR32/BL21(DE3)pLysS工程菌為：誘導(dǎo)時(shí)菌體OD600nm=30，溫度

3、30℃，0.4％(w/v)的Gly/Ala濃度。對(duì)RGD-重組蛛絲蛋白工程菌進(jìn)行大規(guī)模目的蛋白純化，以獲得用于組織工程研究的基礎(chǔ)原材料(pNSR16和pNSR32重組蛛絲蛋白)。 按本室建立的膜制備方法，選用不含RGD(Arg-Gly-Asp)位點(diǎn)的pNS2和含有RGD位點(diǎn)的pNSR16蛛絲蛋白以及聚乙烯醇(PVA)制備膜材料，并將其用于大鼠體內(nèi)植入實(shí)驗(yàn)，比較了它們的組織相容性的異同；其中，設(shè)定pNS2和pNSR16支架材料為實(shí)

4、驗(yàn)組，PVA支架材料作為陽(yáng)性對(duì)照，以空白組作為陰性對(duì)照進(jìn)行實(shí)驗(yàn)，觀察在不同的時(shí)期的體內(nèi)植入情況。實(shí)驗(yàn)結(jié)果根據(jù)國(guó)家標(biāo)準(zhǔn)GB/T16886-6植入后局部反應(yīng)試驗(yàn)證明pNS2和pNSR16支架材料均能在一定程度上抑制炎癥細(xì)胞生長(zhǎng)，顯示出良好的組織相容性，其中以pNSR16支架材料最佳。 在此基礎(chǔ)上，將都含有RGD位點(diǎn)但分子量不同的重組蛛絲蛋白pNSR16、pNSR32以及膠原蛋白作為三種生物敷料應(yīng)用于SD大鼠的深Ⅱ度皮膚燙傷修復(fù)實(shí)驗(yàn)。

5、大鼠燙傷模型通過(guò)采用直徑2.0cm的砝碼(50g)沸水煮15min，壓于大鼠背部脫毛區(qū)持續(xù)15s來(lái)建立，組織學(xué)檢測(cè)該模型符合深Ⅱ度燙傷病理學(xué)特征。以pNSR16、pNSR32蛛絲蛋白膜材料為實(shí)驗(yàn)組，膠原蛋白膜材料為陽(yáng)性對(duì)照，空白組為陰性對(duì)照，對(duì)燙傷模型進(jìn)行皮膚修復(fù)。實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)燙傷創(chuàng)面外敷pNSR16蛛絲蛋白和oNSR32蛛絲蛋白均可以縮短創(chuàng)面愈合時(shí)間，提高創(chuàng)面愈合率，增加創(chuàng)面羥脯氨酸含量水平，并且bFGF因子的表達(dá)水平均高于陽(yáng)性和陰性對(duì)照