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文檔簡介
1、背景:T淋巴細胞在體內(nèi)主要介導(dǎo)細胞免疫應(yīng)答,整個應(yīng)答過程分為三個階段:T細胞特異性識別抗原階段,T細胞活化、增殖和分化階段,T細胞應(yīng)答的效應(yīng)階段。T細胞共刺激在T細胞活化、增殖、分化和生存中發(fā)揮重要作用。
共刺激涉及效應(yīng)淋巴細胞表面配體受體的相互作用。破骨細胞抑制凝集素相關(guān)蛋白2(Osteoclast inhibit lectin related protein2, OCILRP2)基因最初從成骨細胞中分離獲得,它高表達于脾臟
2、、胸腺、B淋巴細胞、DC及活化的T細胞中,而靜止的T細胞中OCILRP2的表達水平很低。研究表明OCILRP2是小鼠T細胞活化共刺激中的一個重要的活化受體,其配體為NKRP1f。
OCILRP2是C型凝集素樣受體分子。C型凝集素樣受體分子在固有免疫及獲得性免疫應(yīng)答中通過與其配體結(jié)合而發(fā)揮重要的作用,其家族成員NKG2D缺少細胞質(zhì)信號傳導(dǎo)基序,因而通過與不同的接頭蛋白結(jié)合激活NK細胞及CD8+T細胞。OCILRP2蛋白胞內(nèi)段很短
3、,同樣缺少細胞質(zhì)信號傳導(dǎo)基序,不能傳遞信號,所以我們推測OCILRP2可能類似于NKG2D,通過與跨膜接頭蛋白DAP12相互作用而活化下游信號通路。研究表明OCILRP2沉默的T細胞中酪氨酸磷酸化的lck減少,活化的T細胞中PI3-K的酪氨酸磷酸化不變。然而OCILRP2共刺激T細胞活化的確切機制及相關(guān)的信號轉(zhuǎn)導(dǎo)通路尚不清楚。
目的:研究OCILRP2在小鼠T細胞活化過程中的共刺激作用及其機制,鑒定與OCILRP2發(fā)揮協(xié)同作用
4、的接頭蛋白,探索其介導(dǎo)T細胞活化的信號通路,豐富T細胞活化的共刺激理論,為深入理解T細胞活化的分子機制提供新線索。
方法:通過免疫共沉淀、GST pull down、激光共聚焦顯微鏡CLSM等實驗鑒定與OCILRP2相互作用的接頭蛋白分子。構(gòu)建了全長、胞內(nèi)段、胞外段加跨膜區(qū)重組OCILRP2蛋白,用來分析OCILRP2與接頭蛋白分子相互作用的區(qū)域。CD3/CD28抗體及PMA刺激小鼠T淋巴瘤EL4細胞,檢測刺激前后細胞因子的分
5、泌、細胞增殖、凋亡、細胞周期等生物學(xué)特征,運用熒光定量 PCR技術(shù)檢測某些轉(zhuǎn)錄因子的變化,同時用免疫印跡技術(shù)尋找與OCILRP2相關(guān)的信號轉(zhuǎn)導(dǎo)通路。
結(jié)果:成功構(gòu)建了GST-DAP12、GST-OCILRP2胞內(nèi)段、GST-OCILRP2胞外段加跨膜區(qū)的融合蛋白,鑒定出OCILRP2與接頭蛋白分子DAP12相互作用,且只有胞外段加跨膜區(qū)的重組蛋白可與DAP12蛋白質(zhì)相互作用,DAP12與Ras不發(fā)生相互作用。
激光共
6、聚焦結(jié)果顯示OCILRP2與DAP12在EL4細胞膜上共定位。
靜止的EL4細胞系中OCILRP2主要在細胞漿中表達,用CD3/CD28抗體激活的EL4細胞,受體由胞內(nèi)轉(zhuǎn)運到細胞表面,而用PMA處理的EL4細胞沒有表現(xiàn)出這種易位現(xiàn)象。DAP12經(jīng)抗體刺激前后其膜上蛋白表達情況不發(fā)生改變。
小鼠淋巴瘤細胞EL4在未受到任何刺激的情況下分泌IL-2的水平很低,經(jīng)CD3/CD28抗體刺激后,EL4分泌IL-2的水平顯著升高
7、。并且隨著CD3抗體濃度的升高和刺激時間的加長,IL-2的分泌水平也增高,摸索出CD3/CD28抗體刺激EL4細胞的最佳抗體濃度和刺激時間。不同處理組對EL4細胞進行刺激48h,發(fā)現(xiàn)加入了OCILRP2抗體組的IL-2的分泌水平有所降低。CD3/CD28抗體濃度增加,對EL4細胞增殖有促進作用,加入OCILRP2抗體組與沉默組EL4增殖情況較CD3/CD28抗體減慢。而加入外源性IL-2抗體并不影響EL4細胞的增殖。OCILRP2不影響
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