MICA-NKG2D相互作用活化γδT細(xì)胞的機(jī)制研究.pdf

1、受體NKG2D屬C型凝集素家族跨膜蛋白，廣泛表達(dá)在NK細(xì)胞、CD8+的αβT細(xì)胞和γδT細(xì)胞表面。MHC-Ⅰ類鏈相關(guān)分子A(MHCclassⅠchain-relatedmoleculesA，MICA)是人類NKG2D識別的配體之一，應(yīng)激性表達(dá)在一些腫瘤細(xì)胞或病原體感染細(xì)胞的表面，MICA的可溶性表達(dá)可能是導(dǎo)致這些腫瘤細(xì)胞“免疫逃逸”的重要原因之一。NKG2D-配體(NKG2DL)產(chǎn)生的活化信號既能直接活化NK細(xì)胞，又能以協(xié)同刺激的方式促

2、進(jìn)CD8+αβT細(xì)胞的活化。然而，NKG2DL刺激γδT細(xì)胞活化的方式目前存在爭議。人類γδT細(xì)胞主要包括兩個亞群：分布在外周血中的Vγ9/δ2T細(xì)胞和分布于粘膜上皮組織的Vδ1T細(xì)胞，Vγ9/δ2T細(xì)胞抗原識別受體(Tcellreceptor，TCR)可識別小分子磷酸化抗原，Vδ1TCR可識別應(yīng)激性分子MICA/MICB。 為了研究MICA-NKG2D相互作用在Vγ9/δ2T細(xì)胞和Vδ1T細(xì)胞活化和效應(yīng)中的作用機(jī)制，我們進(jìn)行了

3、以下研究：1、從人類外周血中成功克隆了NKG2D的cDNA，并利用pET原核表達(dá)系統(tǒng)表達(dá)了人NKG2D分子胞外區(qū)(80～216氨基酸)的重組蛋白，經(jīng)純化復(fù)性后獲得了高純度的人rNKG2D蛋白。2、用雜交瘤技術(shù)制備rNKG2D分子的單克隆抗體。3、用固相化anti-pan-γδTCR單抗擴(kuò)增人PBMC，得到純度達(dá)90％以上Vγ9/δ2T細(xì)胞；用固相化rMICA蛋白擴(kuò)增卵巢癌(OEC)患者腫瘤浸潤淋巴細(xì)胞(TIL)，獲得純度為68％的Vδ1

4、T細(xì)胞。4、檢測anti-NKG2D單抗或rMICA蛋白封閉前后，Vγ9/δ2T細(xì)胞和Vδ1T細(xì)胞對Daudi、HCT-116和HT-29腫瘤細(xì)胞的殺傷活性。在效靶比10∶1時，anti-NKG2D單抗對Vγ9/δ2T細(xì)胞殺傷HCT-116和HT-29細(xì)胞的阻斷率分別為20％和10％，而rMICA蛋白的阻斷效率分別為12％和5％；在相同效靶比下，anti-NKG2D單抗對Vδ1T細(xì)胞殺傷HCT-116和HT-29細(xì)胞的阻斷率分別為42％

5、和35％，rMICA蛋白的阻斷率分別為18％和20％。5、構(gòu)建表達(dá)不同形式MICA分子和eGFP融合蛋白的真核表達(dá)體系，瞬時轉(zhuǎn)染MICA-的CHO細(xì)胞和Daudi細(xì)胞，檢測γδT細(xì)胞對表達(dá)不同形式MICA分子靶細(xì)胞的殺傷效率。 通過上述工作得到以下結(jié)論：1、anti-NKG2D單抗或rMICA蛋白能阻斷Vγ9/δ2T細(xì)胞和Vδ1T細(xì)胞對MICA+腫瘤細(xì)胞的殺傷，anti-NKG2D單抗的阻斷作用強(qiáng)于rMICA蛋白；2、MICA分