MICA-NKG2D相互作用活化γδT細胞的機制研究.pdf

1、受體NKG2D屬C型凝集素家族跨膜蛋白，廣泛表達在NK細胞、CD8+的αβT細胞和γδT細胞表面。MHC-Ⅰ類鏈相關分子A(MHCclassⅠchain-relatedmoleculesA，MICA)是人類NKG2D識別的配體之一，應激性表達在一些腫瘤細胞或病原體感染細胞的表面，MICA的可溶性表達可能是導致這些腫瘤細胞“免疫逃逸”的重要原因之一。NKG2D-配體(NKG2DL)產(chǎn)生的活化信號既能直接活化NK細胞，又能以協(xié)同刺激的方式促

2、進CD8+αβT細胞的活化。然而，NKG2DL刺激γδT細胞活化的方式目前存在爭議。人類γδT細胞主要包括兩個亞群：分布在外周血中的Vγ9/δ2T細胞和分布于粘膜上皮組織的Vδ1T細胞，Vγ9/δ2T細胞抗原識別受體(Tcellreceptor，TCR)可識別小分子磷酸化抗原，Vδ1TCR可識別應激性分子MICA/MICB。 為了研究MICA-NKG2D相互作用在Vγ9/δ2T細胞和Vδ1T細胞活化和效應中的作用機制，我們進行了

3、以下研究：1、從人類外周血中成功克隆了NKG2D的cDNA，并利用pET原核表達系統(tǒng)表達了人NKG2D分子胞外區(qū)(80～216氨基酸)的重組蛋白，經(jīng)純化復性后獲得了高純度的人rNKG2D蛋白。2、用雜交瘤技術制備rNKG2D分子的單克隆抗體。3、用固相化anti-pan-γδTCR單抗擴增人PBMC，得到純度達90％以上Vγ9/δ2T細胞；用固相化rMICA蛋白擴增卵巢癌(OEC)患者腫瘤浸潤淋巴細胞(TIL)，獲得純度為68％的Vδ1

4、T細胞。4、檢測anti-NKG2D單抗或rMICA蛋白封閉前后，Vγ9/δ2T細胞和Vδ1T細胞對Daudi、HCT-116和HT-29腫瘤細胞的殺傷活性。在效靶比10∶1時，anti-NKG2D單抗對Vγ9/δ2T細胞殺傷HCT-116和HT-29細胞的阻斷率分別為20％和10％，而rMICA蛋白的阻斷效率分別為12％和5％；在相同效靶比下，anti-NKG2D單抗對Vδ1T細胞殺傷HCT-116和HT-29細胞的阻斷率分別為42％

5、和35％，rMICA蛋白的阻斷率分別為18％和20％。5、構(gòu)建表達不同形式MICA分子和eGFP融合蛋白的真核表達體系，瞬時轉(zhuǎn)染MICA-的CHO細胞和Daudi細胞，檢測γδT細胞對表達不同形式MICA分子靶細胞的殺傷效率。 通過上述工作得到以下結(jié)論：1、anti-NKG2D單抗或rMICA蛋白能阻斷Vγ9/δ2T細胞和Vδ1T細胞對MICA+腫瘤細胞的殺傷，anti-NKG2D單抗的阻斷作用強于rMICA蛋白；2、MICA分