MICA-NKG2D通路介導(dǎo)對口腔鱗癌免疫殺傷效應(yīng)的實驗研究.pdf

1、口腔鱗狀細(xì)胞癌是口腔頜面部最常見的惡性腫瘤,嚴(yán)重危害人類健康。已有研究表明,口腔鱗癌患者免疫功能低下,且與病變的發(fā)展和預(yù)后密切相關(guān),因此通過免疫治療來提高患者生存率已成為目前的一個研究熱點。
　　 目的:探討MICA-NKG2D信號通路關(guān)鍵分子在口腔鱗癌發(fā)生發(fā)展過程中的表達(dá)及其臨床意義。建立MICA穩(wěn)定過表達(dá)的口腔鱗癌細(xì)胞系,通過體內(nèi)外實驗研究MICA過表達(dá)對NK及CTL細(xì)胞NKG2D的表達(dá)及細(xì)胞毒作用的影響,以期為利用MICA

2、-NKG2D信號通路作為口腔鱗癌的免疫治療靶標(biāo)提供實驗依據(jù)。
　　 方法:1.實時定量PCR和免疫組織化學(xué)技術(shù)檢測口腔鱗癌組織標(biāo)本mMICA mRNA及蛋白的表達(dá),ELISA與流式細(xì)胞術(shù)檢測口腔鱗癌患者血清中sMICA及外周血PBMC中NKG2D的表達(dá),采用SPSSl6.0軟件統(tǒng)計,分析其與口腔鱗癌患者臨床病理參數(shù)的關(guān)系。2.PCR技術(shù)擴增pCMV-SPORT6-MICA中編碼MICA基因全長的cDNA序列,重組至有綠色熒光蛋白

3、標(biāo)記的真核表達(dá)載體pEGFP-N1,構(gòu)建最終表達(dá)載體pEGFP-N1-MICA,脂質(zhì)體法轉(zhuǎn)染Tca8113-Tb細(xì)胞,G418篩選,熒光顯微鏡下觀察綠色熒光蛋白的表達(dá),有限稀釋法建立穩(wěn)定過表達(dá)MICA基因的Tea8113-Tb細(xì)胞系,RT-PCR、real time PCR和免疫細(xì)胞化學(xué)技術(shù)驗證MICA在該細(xì)胞中的表達(dá)情況。3.通過繪制細(xì)胞生長曲線、檢測細(xì)胞周期、平板集落形成及裸鼠皮下成瘤等方法對穩(wěn)定轉(zhuǎn)染并過表達(dá)MICA的Tca8113

4、-Tb細(xì)胞系進行生物學(xué)特性鑒定。乳酸脫氫酶釋放法及流式細(xì)胞術(shù)分析Tea8113-Tb過表達(dá)MICA對NK與CTL細(xì)胞殺傷活性及NKG2D表達(dá)的影響。
　　 結(jié)果:1.免疫組織化學(xué)結(jié)果提示MICA分子定位于細(xì)胞胞漿與胞膜,表達(dá)強度癌旁組織高于口腔鱗癌(P＜0.05),但癌旁組織與正常口腔粘膜以及正?？谇徽衬づc鱗癌之間,差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P＞0.05),口腔鱗癌不同臨床病理參數(shù)組間的比較,差異亦無統(tǒng)計學(xué)意義(P＞0.05)。RT-P

5、CR及real time PCR結(jié)果提示口腔鱗癌MICAmRNA表達(dá)的相對含量顯著高于癌旁組織(P＜0.05),且與臨床分期、頸部淋巴結(jié)是否轉(zhuǎn)移相關(guān)(P＜0.05)?？谇击[癌組織MICA mRNA與蛋白的表達(dá)無相關(guān)性(P＞0.05)。2.78例口腔鱗癌患者血清sMICA檢測陽性率98.7％(77/78),其含量的95％可信區(qū)間為74.30～93.95pg/mL,中位數(shù)為82.17pg/mL;19例健康成年人血清sMICA檢測陽性率94.

6、7％(18/19),其含量的95％可信區(qū)間為29.48～50.30pg/mL,中位數(shù)為37.54pg/mL,口腔鱗癌患者血清sMICA.含量顯著高于健康成年人(P＜0.01),且不同腫瘤大小、臨床分期及頸部淋巴結(jié)是否轉(zhuǎn)移的組間比較,差異具有統(tǒng)計學(xué)意義(P＜0.05),而不同性別、年齡及腫瘤分化程度的組間比較,差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P＞0.05)。3.56例口腔鱗癌患者PBMC表面NKG2D表達(dá)的陽性率為(12.49±5.26)％,顯著低于正

7、常健康成人(22.93±8.14)％(P＜0.05)。口腔鱗癌患者PBMC表面NKG2D表達(dá)的陽性率在不同腫瘤大小和臨床分期組間比較,差異具有統(tǒng)計學(xué)意義(P＜0.05),而不同性別、年齡、腫瘤部位、病理分化程度及頸部淋巴結(jié)是否轉(zhuǎn)移的組間比較,差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P＞0.05)。4.通過PCR技術(shù)獲取了MICA基因全長并成功克隆入載體,測序鑒定該序列與GenBank中的序列相同。轉(zhuǎn)染后細(xì)胞可見綠色熒光蛋白表達(dá),RT-PCR、real tim

8、e PCR及免疫細(xì)胞化學(xué)檢測到目的基因MICA在轉(zhuǎn)染細(xì)胞中過表達(dá)。5.口腔鱗癌細(xì)胞轉(zhuǎn)染并過表達(dá)MICA基因后生長曲線、細(xì)胞周期、平板集落形成及裸鼠皮下成瘤等主要生物學(xué)特性未發(fā)生改變,但能顯著增強NK與CTL細(xì)胞殺傷活性并上調(diào)其表面NKG2D的表達(dá),與未轉(zhuǎn)染及轉(zhuǎn)染空白載體的細(xì)胞比較,差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P＜0.05)。
　　 結(jié)論:MICA-NKG2D信號通路中的關(guān)鍵分子與口腔鱗癌的發(fā)生發(fā)展密切相關(guān)?？谇击[癌細(xì)胞過表達(dá)MICA后能上