MTDH介導AKT信號通路調(diào)控頭頸鱗癌侵襲轉(zhuǎn)移的實驗研究.pdf

1、第一章MTDH在頭頸鱗癌中的表達及其臨床意義
　　目的：異粘蛋白(Metadherin，MTDH)是新近發(fā)現(xiàn)的癌基因，在大多數(shù)腫瘤中高表達，與腫瘤侵襲轉(zhuǎn)移密切相關(guān)。然而，其在頭頸鱗癌侵襲轉(zhuǎn)移中的作用并不十分清楚。因此，本研究檢測MTDH在頭頸鱗癌中的表達及臨床意義，并初步探討其在頭頸鱗癌侵襲轉(zhuǎn)移中的作用及相關(guān)機制。
　　方法：免疫組織化學方法檢測189例頭頸鱗癌石蠟組織標本及27例癌旁粘膜組織中MTDH、上皮-間質(zhì)轉(zhuǎn)化(Ep

2、ithelial to Mesenchymal Transition，EMT)標志蛋白E-cadherin及血管內(nèi)皮生長因子(Vascular Endothelial Growth Factor，VEGF)的表達及分布特征，并分析MTDH表達與臨床病理參數(shù)及預后的關(guān)系，以及MTDH表達與E-cadherin、VEGF表達的相關(guān)性。
　　結(jié)果：1）MTDH蛋白在頭頸鱗癌組織中表達上調(diào)，且與頭頸鱗癌腫瘤原發(fā)部位(P=0.033)、T分

3、期(P=0.001)、臨床分期(P=0.000)、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移(P=0.000)、腫瘤術(shù)后復發(fā)(P=0.000)密切相關(guān)。2）Kaplan-Meier生存分析結(jié)果顯示MTDH蛋白高表達組患者術(shù)后復發(fā)和死亡率較低表達組明顯增高，5年累積總生存率分別為37.6％與72.6％，5年累積無瘤生存率分別為31.8％和68.6％，log-rank檢驗證實兩組差異有統(tǒng)計學意義(x2=20.135，P＜0.001;x2=22.058,P＜0.001)。多

4、因素回歸分析表明，MTDH表達水平是頭頸鱗癌患者的獨立預后因素。3）Spearman秩相關(guān)檢測結(jié)果顯示MTDH表達與E-cadherin表達水平呈負相關(guān)(r=-0.336，P＜0.001)，與VEGF表達呈正相關(guān)(r=0.319，P＜0.001)。
　　結(jié)論：1）MTDH蛋白在頭頸鱗癌中高表達，其高表達與頭頸鱗癌患者的腫瘤發(fā)生部位、T分期、臨床分期、復發(fā)及轉(zhuǎn)移密切相關(guān)，并顯著影響患者的預后。2）MTDH表達與E-cadherin表

5、達水平呈負相關(guān)，與VEGF表達呈正相關(guān)，提示MTDH可能調(diào)控頭頸鱗癌EMT和血管新生。
　　第二章 MTDH通過上皮-間質(zhì)轉(zhuǎn)化調(diào)控頭頸鱗癌細胞侵襲轉(zhuǎn)移
　　目的：前述研究證實MTDH與頭頸鱗癌轉(zhuǎn)移和EMT分子標志物E-cadherin密切相關(guān)，因此，我們進一步檢測MTDH對頭頸鱗癌細胞體外遷移侵襲和EMT的調(diào)控。
　　方法：利用慢病毒載體介導的MTDH表達及沉默質(zhì)粒轉(zhuǎn)染頭頸鱗癌細胞Tu686，建立穩(wěn)定高表達和沉默MTD

6、H的頭頸鱗癌細胞株，相差顯微鏡下觀察細胞形態(tài)改變;Western blot檢測EMT分子標志物E-cadherin、vimentin表達水平改變;劃痕愈合實驗、transwell侵襲小室實驗檢測頭頸鱗癌細胞體外遷移及侵襲潛能變化情況。
　　結(jié)果：建立了穩(wěn)定高表達和沉默MTDH的頭頸鱗癌細胞株及空載體對照細胞株，并分別命名為TU686MTDHpcDNA(+)（MTDH過表達細胞）、TU686MTDHpcDNA(-)（轉(zhuǎn)染空載體細胞）

7、、Tu686MTDHRNAi(+)(MTDH沉默細胞)、TU686MTDHRNAi(-)（轉(zhuǎn)染空載體細胞）。Tu686細胞MTDH蛋白過表達后，細胞間連接松散，細胞形態(tài)發(fā)生改變，有偽足形成，且E-cadherin表達下降，vimentin表達升高，細胞遷移、侵襲能力增強。48 h后Tu686細胞、TU686MTDHpcDNA(-)細胞、Tu686MTDHpcDNA(+)細胞劃痕愈合率分別為15±14％，18±8％，84±15％(P＜0.

8、05)。48 h后穿過transwell侵襲小室的Tu686細胞、TU686MTDHpcDNA(-)細胞、Tu686MTDHpcDNA(+)細胞細胞數(shù)分別為224±15，214±6，317±8(P＜0.05)。而TU686MTDHRNAi(+)細胞與TU686MTDHRNAi(-)細胞、Tu686細胞比較，E-cadherin表達升高，vimentin表達檢測不到，細胞遷移、侵襲潛能明顯降低。48 h后Tu686細胞、TU686MTDH

9、RNAi(-)細胞、Tu686MTDHRNAi(+)細胞的劃痕愈合率分別為29±5％，28±6％，9±4％(P＜0.05)。48 h后穿過transwell侵襲小室的Tu686細胞、TU686MTDHRNAi(-)細胞、TU686MTDHRNAi(+)細胞細胞數(shù)分別為250±20，241±24，139±12(P＜0.05)。
　　結(jié)論：MTDH可通過EMT調(diào)控頭頸鱗癌細胞體外遷移侵襲。
　　第三章 MTDH調(diào)控頭頸鱗癌細胞V

10、EGF表達
　　目的：血管生成因子調(diào)控血管新生在腫瘤侵襲轉(zhuǎn)移過程中起重要作用。前期研究表明MTDH表達與VEGF表達呈正相關(guān)。進而，本研究在體外實驗檢測MTDH對頭頸鱗癌中VEGF表達的調(diào)控。
　　方法：利用慢病毒載體建立穩(wěn)定高表達和沉默MTDH的頭頸鱗癌細胞株基礎上，western blot檢測VEGF細胞內(nèi)表達水平改變;酶聯(lián)免疫吸附法(ELISA)檢測VEGF細胞外分泌情況。
　　結(jié)果：Western blot結(jié)果

11、表明MTDH過表達后Tu686細胞VEGF的胞內(nèi)表達增高，相反，MTDH表達沉默后，Tu686細胞VEGF的胞內(nèi)表達降低。Elisa結(jié)果顯示Tu686MTDHpcDNA(+)細胞、Tu686MTDHpcDNA(-)細胞、Tu686細胞上清中VEGF含量(pg/ml)分別為498.65±32.19，324.14±33.66，334.93±42.26，Tu686MTDHpcDNA(+)細胞組與TU686MTDHpcDNA(-)細胞組、Tu6

12、86細胞組比較差異均有統(tǒng)計學意義(P＜0.05)，MTDH促進Tu686細胞VEGF胞外分泌。MTDH表達被抑制后VEGF胞外分泌降低，TU686MTDHRNAi(+)細胞、TU686MTDHRNAi(-)細胞、Tu686細胞上清中VEGF含量(pg/ml)分別為267.71±41.39，427.19±60.47，412.48±35.72，TU686MTDHRNAi(+)細胞組與TU686MTDHRNAi(-)細胞組、Tu686細胞組比

13、較差異均有統(tǒng)計學意義(P＜0.05)。
　　結(jié)論：MTDH可調(diào)控頭頸鱗癌細胞VEGF的胞內(nèi)表達和胞外分泌，提示MTDH可能調(diào)控頭頸鱗癌血管新生。
　　第四章 MTDH通過AKT信號通路調(diào)控頭頸鱗癌EMT及VEGF表達
　　目的：探討MTDH調(diào)控頭頸鱗癌EMT及VEGF表達的分子機制。
　　方法：利用慢病毒載體建立穩(wěn)定高表達和沉默MTDH的頭頸鱗癌細胞株基礎上，western blot檢測AKT、p-AKT表達水平

14、;小RNA干擾技術(shù)沉默TU686MTDHpcDNA(+)細胞的AKT表達，western blot、劃痕愈合實驗、transwell侵襲小室實驗分別檢測EMT分子標志物(E-cadherin、vimentin)表達水平改變、遷移及侵襲潛能變化情況;Western blot、ELISA實驗分別檢測VEGF細胞內(nèi)表達和細胞外分泌情況。
　　結(jié)果：MTDH過表達后AKT、p-AKT表達增加，相反，沉默MTDH表達后AKT、p-AKT表達

15、降低。siRNA抑制Tu686MTDHpcDNA(+)細胞的AKT表達后，p-AKT表達降低，E-cadherin表達升高，vimentin表達降低，細胞遷移、侵襲能力也降低（78±15％ vs11±5％;274±22 vs157±22;P＜0.05）;同時，western bloth和ELISA實驗檢測到VEGF的胞內(nèi)表達及胞外分泌均降低。TU686MTDHpcDNA㈩細胞組、siRNA組胞外VEGF含量分別為535.27±47.72