小膠質細胞在EAE中的活化及其作用的實驗研究.pdf

1、本研究利用實驗性自身免疫性腦脊髓炎模型,觀察不同神經功能評分EAE的病理學變化,并檢測中樞神經系統內小膠質細胞的活化及CD4+T細胞的變化,觀察二者的相互作用,試圖探討小膠質細胞在MS/EAE發(fā)病和緩解中的作用。應用熒光定量PCR觀察CD4+T細胞和小膠質細胞在mRNA水平上的變化,同時觀察腦組織內細胞因子IFN-γ、IL-17、IL-10的變化,探討這些細胞因子在EAE發(fā)病過程中的作用。為此,我們用MOG35-55抗原輔以完全弗氏佐劑

2、免疫C57BL/6小鼠,通過對小鼠體重、癥狀及中樞神經系統病理改變的觀察,評估EAE模型的建立情況,采用國際公認的神經功能評分標準對發(fā)病小鼠的臨床癥狀進行評分。同時利用病理學染色觀察EAE小鼠不同時期的病理學改變,用HE染色、Luxol Fast Blue髓鞘染色和Bielschowsky銀染分別評估炎性細胞浸潤、髓鞘脫失和軸索損傷情況。利用免疫組織化學染色法對CD4+T細胞和小膠質細胞進行標記,觀察兩種細胞的變化及二者之間是否存在相互

3、作用。應用熒光定量PCR技術驗證二者在mRNA水平上的變化。用半定量PCR和熒光定量PCR檢測不同病程分期EAE小鼠腦組織中細胞因子干擾素-gamma(Interferon-γ,IFN-γ),白細胞介素-17(Interleukin-17,IL-17)及IL-10mRNA的表達情況。通過不同分值EAE模型與對照組的比較,從病理學、免疫學和分子學水平動態(tài)的觀察EAE模型的變化,進一步闡明EAE及MS發(fā)病機制,為研發(fā)MS新的治療手段提供實驗

4、依據。
　　本實驗成功建立的EAE模型,小鼠發(fā)病率為85％,最高臨床癥狀的神經功能評分可達4.0分。小鼠臨床癥狀最早出現于免疫后第13天,大部分以體重減輕和尾部張力下降為首發(fā)癥狀,隨繼出現尾巴無力癱瘓、拖行、步態(tài)蹣跚及雙后肢無力癱瘓等神經系統癥狀,有些小鼠進展為四肢癱瘓,甚至死亡。平均發(fā)病時間為(15.3±2.1)天,平均臨床分值為2.59±0.65分。對照組小鼠均未出現神經系統癥狀,體重持續(xù)增加。病理學改變是:脊髓HE染色顯示,

5、在疾病誘導期脊髓實質內出現炎性細胞,但數量不多。隨著疾病的進展,炎性細胞的浸潤越來越多,在血管周圍可見到典型的血管“袖套樣”改變,在疾病恢復期,浸潤的炎性細胞逐漸減少。可見到膠質細胞增生,形成膠質結節(jié),在疾病高峰期還可見到明顯的衛(wèi)星現象及噬神經現象。髓鞘染色可見大小不等的片狀脫髓鞘區(qū),呈空泡樣變;在疾病恢復期,脫髓鞘區(qū)域內有髓鞘重建。Bielschowsky銀染顯示大量軸索腫脹、變形、斷裂,形成軸索卵圓體。免疫學染色見隨著EAE疾病的進

6、展和恢復,CD4+T細胞、小膠質細胞數量呈現明顯的動態(tài)改變,隨著疾病的進展,數量增加,在疾病高峰期達到最大值,恢復期數量有所減少。小膠質細胞的形態(tài)也呈動態(tài)改變,由靜息狀態(tài)下的細小分枝狀分化為粗短分枝狀的反應性小膠質細胞,在疾病高峰期呈阿米巴樣或橢圓狀,恢復期逐漸恢復至細小分枝狀,小膠質細胞與CD4+T細胞之間的動態(tài)改變有一定的關聯性,推測二者之間存在相互作用。從mRNA水平上驗證了CD4+T細胞和小膠質細胞的動態(tài)變化。半定量PCR和熒光

7、定量PCR檢測出腦組織內炎性因子IFN-γ、IL-17和IL-10 mRNA表達的變化,結果顯示,IFN-γ、IL-17和IL-10 mRNA的表達呈單峰狀曲線,與疾病進展密切相關。
　　通過以上研究得到以下結論:
　　1.隨著EAE疾病的進展,小膠質細胞發(fā)生活化,數量和形態(tài)均呈動態(tài)改變,表明小膠質細胞在EAE的發(fā)生發(fā)展中的功能也發(fā)生改變,對疾病的進展和恢復具有重要作用。
　　2. CD4+T細胞和小膠質細胞之間存在相

8、互作用。
　　神經性炎癥是MS/EAE的病理特征,特點是激活的小膠質細胞和浸潤的T細胞共同導致神經元損傷。作為中樞神經系統的免疫細胞,小膠質細胞的活化被認為是中樞神經系統微環(huán)境變化最敏感的標志,但小膠質細胞的作用是雙向的,既可以通過吞噬組織中的病原體及有害顆粒對神經元起保護作用,也可以在致炎因子的作用下激活成反應性小膠質細胞,分泌炎性細胞因子對神經元起毒性作用。在EAE中,小膠質細胞的激活是疾病發(fā)生和發(fā)展過程的重要參與者,目前對小