協(xié)同刺激分子在介導日本血吸蟲感染小鼠Th1-Th2極化中的作用及其分子機制.pdf

1、血吸蟲病是危害性僅次于瘧疾的一種重要熱帶病。本項研究探討了特異性組分抗原和協(xié)同刺激分子表達與血吸蟲致病過程中Thl/Th2免疫偏移的相關(guān)性，闡明血吸蟲感染宿主Th2優(yōu)勢應答的免疫學分子基礎(chǔ)，并以協(xié)同刺激分子為靶點尋找可調(diào)控Thl/Th2極化的關(guān)鍵信號分子，為有效控制蟲卵肉芽腫病變及肝纖維化發(fā)生發(fā)展探索新的途徑，并為血吸蟲病疫苗的研究策略提供新的思路。
　　 一、日本血吸蟲感染小鼠慢性致病過程中協(xié)同刺激分子動態(tài)變化及免疫病理

2、>　　 應用流式細胞術(shù)觀察日本血吸蟲感染后4w～20w小鼠脾CD4+T淋巴細胞協(xié)同刺激分子表達水平，同時觀察小鼠肝組織肉芽腫病理改變和肉芽腫細胞協(xié)同刺激分子表達水平的變化。結(jié)果發(fā)現(xiàn)血吸蟲慢性致病過程中協(xié)同刺激分子表達譜的動態(tài)變化與蟲卵肉芽腫病變密切相關(guān)。感染早期炎癥劇烈，CD80、4-1BB高表達，到慢性期蟲卵形成并沉積后，肉芽腫炎癥顯著減輕，ICOS、CD86、CD40、OX40高表達，結(jié)合前期研究結(jié)果及文獻提示CD80、4-1BB

3、主要參與介導血吸蟲感染宿主體內(nèi)Thl極化；ICOS、CD86、CD40、OX40高表達相關(guān)則與宿主1112極化相關(guān)。免疫組化檢測結(jié)果顯示肉芽腫炎性細胞表膜協(xié)同刺激分子的表達水平隨感染時間延長逐漸升高，表明蟲卵肉芽腫炎性細胞表膜協(xié)同刺激分子的表達與蟲卵抗原的持續(xù)性刺激相關(guān)。
　　 二、協(xié)同刺激分子在介導日本血吸蟲感染小鼠Thl/Th2極化中的作用
　　 收集不同病期(4～20w)感染小鼠脾淋巴細胞用SEA進行誘導培養(yǎng)，并采

4、用ELISA雙抗夾心法檢測培養(yǎng)上清中Thl/Th2細胞因子表達水平和小鼠血清中IgG及其亞類IgG1、IgG2a的表達水平。離體實驗結(jié)果顯示感染早期(4w)Thl細胞因子IFN-γ高表達，病程由急性轉(zhuǎn)為慢性時，Thl細胞因子表達下調(diào)而Th2型細胞因子(IL-4、IL-5、IL-10、IL-13)表達水平上調(diào)；體內(nèi)實驗結(jié)果顯示血清抗體IgG及其亞類隨病程發(fā)生改變，尤其是IgG1在7w顯著增高，到肉芽腫形成時后開始略有下降，但仍然處于較高水

5、平；同時Th2分化指數(shù)及IgGl/IgG2a的比值亦隨病程遷延而逐漸升高，說明宿主感染日本血吸蟲后Thl免疫應答水平在急性期達高峰，隨后逐漸下降，而Th2免疫應答水平逐漸上升，整體免疫應答趨勢由1111向Th2方向偏移。
　　 結(jié)合第一部分實驗結(jié)果提示細胞因子和血清抗體的變化趨勢與小鼠脾CD4+T淋巴細胞上協(xié)同刺激分子表達水平變化趨勢相關(guān)，CD80、4-1BB主要參與介導宿主體內(nèi)Thl極化；ICOS、CD86、CD40、OX40

6、主要參與介導Th2極化反應，宿主體內(nèi)免疫應答向Th2偏移。
　　 三、日本血吸蟲功能性組分抗原對協(xié)同刺激分子表達譜及Thl/Th2極化的影響
　　 通過免疫印跡實驗采用不同病期感染血清分析鑒定SEA(卵源性抗原)和AWA（蟲源性抗原）的各組分抗原，發(fā)現(xiàn)不同病期感染血清所識別的SEA和AWA的組分抗原分子條帶有明顯的變化，SEA中的10KDa、18KDa、41KDa及47KdDa的組分蛋白和AWA中的13KDa、37 KD

7、a，57 KDa組分分子可被各病期(6w—20w)的血清抗體所識別，推測這4個組分蛋白可能為主要的功能性抗原，其中可能存在導致Th極化反應發(fā)生偏移的關(guān)鍵分子。
　　 然后用SEA（卵源性抗原）和Sjl6（蟲源性組分抗原）分別誘導致敏小鼠脾淋巴細胞，觀察不同病期小鼠CD4+T細胞表面的協(xié)同刺激分子表達和培養(yǎng)上清中細胞因子的變化，結(jié)果發(fā)現(xiàn)SEA和Sjl6均能誘導4w和7w的小鼠脾淋巴細胞高表達Thl型細胞因子(IFN-γ)，感染慢性

8、期（7w以后）小鼠脾淋巴細胞高表達Th2型細胞因子：脾CD4+T淋巴細胞表面的協(xié)同刺激分子ICOS、CD86、CD40、OX40表達水平在7w升高，尤其是ICOS和CD86的表達水平升高顯著，并且在慢性期仍然維持在較高水平，表明ICOS和CD86的表達水平與Th2型細胞因子表達水平的動態(tài)變化相一致，提示ICOS、CD86、CD40、OX40呈高表達與SEA和Sjl6抗原刺激相關(guān)。比較SEA和Sjl6兩組結(jié)果發(fā)現(xiàn)無顯著性差異，提示SEA和

9、Sjl6均能誘導小鼠脾CD4+T淋巴細胞分泌Th2型細胞因子，使免疫應答向Th2方向偏移。結(jié)合第一、二兩部分實驗結(jié)果說明日本血吸蟲可能存在誘導協(xié)同刺激分子ICOS、CD86高表達的組分抗原，從而導致機體免疫應答向Th2方向偏移。
　　 四、體外干預日本血吸蟲感染小鼠ICOS、CD80、CD86協(xié)同刺激信號對Thl/Th2極化的影響
　　 本實驗觀察了anti-CDS0mAb、anti-CD86mAb和anti-ICOSm

10、Ab三種阻斷抗體對日本血吸蟲感染小鼠不同時期(4w、7w、9w)脾淋巴細胞誘生的Th1/Th2細胞因子表達水平的影響，結(jié)果發(fā)現(xiàn)7w和9w時，除anti-CDS0mAb處理組外，anti-CD86mAb、anti-ICOSmAb、anti-CD80mAb-anti-CD86mAb、anti-ICOSmAb-
　　 anti-CD80mAb處理組能顯著降低Th2型細胞因子IL-4、IL-10的表達水平(P<0.01)，提示干預ICO

11、S、CD86協(xié)同刺激信號能調(diào)控Thl/Th2極化，為在血吸蟲病發(fā)病過程中調(diào)控Thl/Th2極化，從而控制蟲卵肉芽腫病變防止肝纖維化的發(fā)生、發(fā)展提供新的實驗依據(jù)。
　　 綜上所述，本項研究獲得了血吸蟲感染小鼠慢性致病過程中CD4+T淋巴細胞協(xié)同刺激分子動態(tài)表達特征:CD80、4-1BB主要參與介導宿主早期Thl優(yōu)勢應答；而蟲卵肉芽腫形成時ICOS、CD86、CD40、OX40主要參與介導Th2優(yōu)勢應答；探討了協(xié)同刺激分子參與介導日

12、本血吸蟲疾病過程中Thl/Th2極化的機制，發(fā)現(xiàn)協(xié)同刺激分子ICOS、CD86、CD40、OX40在感染后的表達動態(tài)與T112優(yōu)勢應答及其小鼠病理反應相一致，特別是ICOS和CD86可能發(fā)揮重要作用；分析了Thl/Th2極化與血吸蟲組分抗原的相互關(guān)系，進一步闡明了血吸蟲肉芽腫病變的病理分子機制；發(fā)現(xiàn)干預ICOS、CD86介導的協(xié)同刺激信號可調(diào)控Thl/Th2極化，為探索以協(xié)同刺激分子為靶點調(diào)控Thl/Th2免疫偏移，尋找控制血吸蟲卵肉芽