重組人凝血因子Ⅷ(rhFⅧ)表達載體構建及在中國倉鼠卵巢(CHO)細胞中高效表達.pdf

1、目的:凝血因子Ⅷ(FⅧ)是一個血漿大分子糖蛋白，在血液凝固中起重要作用。FⅧ的缺失可導致甲型血友病。目前國內甲型血友病的防治主要依賴于反復給予病人由人血漿制備的FⅧ。然而，臨床上不僅人FⅧ來源有限，而且病人還可能通過輸入人FⅧ時而導致血液傳播性疾病如肝炎、HIV等的發(fā)生。因此，應用重組人凝血因子Ⅷ(rhFⅧ)治療血友病則可避免上述問題。本課題旨在構建rhFⅧ重組表達載體，通過瞬時轉染CHO-dhfr-細胞獲得高效表達的rhFⅧ，從而為大

2、規(guī)模生產rhFⅧ提供實驗理論依據和基礎。
　　材料和方法:pTriEx-4 Neo載體是一多用途表達載體，它可分別用于細菌、昆蟲及哺乳動物細胞的外源性基因的高效表達，它不僅帶有篩選基因Neo用于穩(wěn)定細胞系的建立，而其攜帶的His.Tag、S.Tag、HSV.Tag等標簽便于對目的蛋白的分離純化。CHO細胞是一常用的外源蛋白表達的宿主細胞，它既可以貼壁生長，具有較高的耐受剪切力和滲透壓的能力，又可進行懸浮培養(yǎng)或無血清培養(yǎng)有利于大規(guī)模

3、生產。CHO-dhfr-是二氫葉酸還原酶(DHFR)缺陷的細胞系，當成功轉染含有DHFR的表達載體后，細胞可在不含鳥嘌呤及胸腺嘧啶的培養(yǎng)基中生長。此外，利用甲氨蝶呤(MTX)加壓篩選，可以得到穩(wěn)定表達外源蛋白的細胞系。
　　我們首先將人FⅧ全長序列，IRES和DHFR克隆至pTriEx-4 Neo載體，然后采用聚乙烯亞胺(PEI)融合法將該載體轉染CHO-dhff-細胞進行瞬時高效表達，最后利用rhFⅧ特異性抗體(ELISA試劑盒

4、)檢測細胞rhFⅧ的表達水平。
　　結果與結論:我們成功地構建了重組質粒pTriEx-4-FⅧ-IRES-DHFR高效表達載體，該載體采用PEI導入CHO-dhfr-細胞后實現了外源蛋白(FⅧ)的瞬時表達，且經ELISA法檢測到rhFⅧ的表達水平為2.5ng/ml。
　　本實驗成功建立了一種由CHO-dhfr-細胞瞬時表達rhFⅧ的方法，后續(xù)實驗將試圖建立穩(wěn)定表達rhFⅧ的CHO-dhfr-細胞株，從而為大規(guī)模制備rhFⅧ奠