重組hBMP-2在CHO細胞中的表達、鑒定及活性分析.pdf

1、195828玎南開人學(xué)生命科學(xué)學(xué)院碩士學(xué)位論文南開大學(xué)學(xué)位論文版權(quán)使用授權(quán)書本人完全了解南開大學(xué)關(guān)于收集、保存、使用學(xué)位論文的規(guī)定，同意如下各項內(nèi)容：按照學(xué)校要求提交學(xué)位論文的印刷本和電子版本；學(xué)校有權(quán)保存學(xué)位論文的印刷本和電子版，并采用影印、縮印、掃描、數(shù)字化或其它手段保存論文；學(xué)校有權(quán)提供目錄檢索以及提供本學(xué)位論文全文或者部分的閱覽服務(wù)；學(xué)校有權(quán)按有關(guān)規(guī)定向國家有關(guān)部門或者機構(gòu)送交論文的復(fù)印件和電子版；在不以贏利為目的的前提下，學(xué)校

2、可以適當(dāng)復(fù)制論文的部分或全部內(nèi)容用于學(xué)術(shù)活動。學(xué)位論文作者簽名：侈遭豐∥口‘年pr月研日經(jīng)指導(dǎo)教師同意，本學(xué)位論文屬于保密，在r年解密后適用本授權(quán)書。指導(dǎo)教師簽名：E∑)娣學(xué)位論文作者簽名：滲眸么二天分解密時間：≯口，f年I二月’歲1日各密級的最長保密年限及書寫格式規(guī)定如下：內(nèi)部5年(最長5年，可少于5年)秘密★lO年(最長10年，可少于10年)機密★20年(最長20年，可少于20年)中文摘要重組hBMP2在CHO細胞中的表達、鑒定及活

3、性分析中文摘要BMPs(Bonemorphogenticprote。in，BMP)屬于轉(zhuǎn)化生長因子(Transformationgrowthfactor，TGF)B超家族，BMPs最早是從骨中提取得到，能夠在體內(nèi)誘導(dǎo)異位骨和軟骨形成，迄今為止，已經(jīng)有40多個BMPs基因相繼被克隆。許多BMPs的體外(invitro)和體內(nèi)(invivo)實驗表明BMPs具有調(diào)節(jié)成骨細胞和成軟骨細胞的分化，誘導(dǎo)異位骨形成，促進骨折愈合，及具有控制哺乳動物

4、骨骼不同形態(tài)特征形成的功能。BMP2是BMP家族中的重要一員，其高效的誘導(dǎo)成骨活性已經(jīng)在臨床前以及臨床實驗中得到證實，顯示了在治療難愈性骨折治療，骨質(zhì)疏松癥的預(yù)防，脊柱融合術(shù)，牙齒工程等眾多臨床應(yīng)用中的巨大潛力。本研究采用基因工程的方法，在體外表達重組入骨形態(tài)發(fā)生蛋白2。研究中，我們采用RTPCR、cDNA克隆、真核表達載體構(gòu)建、細胞轉(zhuǎn)染，穩(wěn)定表達細胞系的克隆、WesternBlot等生物學(xué)技術(shù)與方法，在哺乳動物細胞中表達rhBMP2蛋

5、白，篩選穩(wěn)定、高效表達rhBMP2的重組CHO細胞系?，F(xiàn)將已完成的工作報告如下：1rhBMP2真核表達載體的構(gòu)建以本實驗室已構(gòu)建的含有hBMP2cDNA全長序列(GenBankaccessionNoNM001200)的質(zhì)粒pCDNA6AhBMP2為模板，通過PCR反應(yīng)擴增得到hBMP2的cDNA全長序列，并將其連接至表達載體質(zhì)粒pCDNA31()中，構(gòu)建了hBMP一2的真核表達質(zhì)粒pCDNA31()hBMP2，用其轉(zhuǎn)化感受態(tài)細胞叵col

6、iDH5Q，采用菌落PCR的方法篩選陽性菌落，并進一步提取質(zhì)粒DNA進行酶切鑒定，鑒定結(jié)果與預(yù)期吻合，測序結(jié)果表明讀碼框完全J下確。2構(gòu)建穩(wěn)定、高效表達rhBMP2的CHO細胞系將真核表達載體pCDNA31()hBMP2與篩選標(biāo)記載體pSV2dhfr以l：5(摩爾比)混合，利用脂質(zhì)體法共轉(zhuǎn)染CHO(dhfr)細胞。G418及dhfr雙抗性篩選3周后，獲得穩(wěn)定轉(zhuǎn)染hBMP2和空載的細胞系，利用MTX擴增系統(tǒng)大量擴增hBMP2基因在宿主染色