分泌型IgA嵌合抗體基因的構(gòu)建及在CHO細(xì)胞中的表達(dá)研究.pdf

1、本研究選擇在中國倉鼠卵巢(chinese hamster ovary, CHO)細(xì)胞中表達(dá)具有中和活性的抗H5N1病毒的嵌合SIgA抗體，嘗試研發(fā)預(yù)防性分泌型IgA類抗體。 采用本實(shí)驗(yàn)室建立的“基因組DNA剪接(Genomic DNA Splicing，GDS)”技術(shù)，根據(jù)已發(fā)表的人IgJ、pIgR和IGHA的核苷酸序列，通過計算機(jī)軟件分別設(shè)計各個基因片段外顯子的優(yōu)化引物，從人外周血基因組DNA中直接擴(kuò)增各基因的外顯子序列；然后

2、人工設(shè)計融合相鄰?fù)怙@子的融合引物，采用重疊PCR技術(shù)，把各基因片段的外顯子串聯(lián)起來形成全長編碼序列，完成基因組DNA的體外剪接，擴(kuò)增的PCR產(chǎn)物純化后克隆到pGEM-T Easy Vector中。序列分析表明，GDS技術(shù)擴(kuò)增的IgJ、pIgR和IGHA基因與GenBank中的目標(biāo)基因序列完全一致，其中IGHA為IgA2恒定區(qū)的序列。 從分泌抗禽流感H5N1-HA單抗的雜交瘤細(xì)胞HA9中提取總RNA，應(yīng)用RT-PCR擴(kuò)增VK和VH

3、基因及信號肽序列，PCR產(chǎn)物克隆到pMD18-T載體上進(jìn)行序列分析，經(jīng)分析為小鼠免疫球蛋白基因，重鏈可變區(qū)共有414個堿基，前57個核苷酸編碼19個氨基酸前導(dǎo)序列，其VH屬于IgHVI家族，D段來自IgHVIV家族，J段來自IgHV II家族；輕鏈可變區(qū)共有393個堿基，前60個核苷酸編碼20個氨基酸前導(dǎo)序列，V段為IgKVIII家族，J段為IgKJ I家族。 通過融合PCR將鼠源VH基因與人IGHA2基因拼接，VK基因與人CK

4、連接，完成了人/鼠嵌合IgA抗體基因的構(gòu)建。將人/鼠嵌合IgA抗體重、輕鏈基因分別克隆到以CMV早期啟動子引導(dǎo)，以二氫葉酸還原酶基因(DHFR)和新霉素抗性基因(NEO)為雙篩選標(biāo)記pEF-dhfr-Neo載體中。將IgJ、pIgR基因克隆劍以CMV早期啟動子引導(dǎo)，以新霉素抗性基因(NEO)為篩選標(biāo)記pcDNA3.1(+)中。同時通過“質(zhì)粒快速定帶點(diǎn)突變”技術(shù)將pcDNA3.1(+)-pIgR中多聚免疫球蛋白受體基因胞內(nèi)區(qū)突變掉，從而完

5、成人分泌成分(secretory component，SC)的真核表達(dá)載體構(gòu)建。 用構(gòu)建的pEF-IGHA9和pEF-IGK9表達(dá)質(zhì)粒轉(zhuǎn)染CHO/dhfr細(xì)胞，經(jīng)選擇培養(yǎng)基(無次黃嘌呤、胸腺嘧啶的DMEM)篩選，挑取陽性克隆用MTX加壓進(jìn)一步提高表達(dá)量。對此細(xì)胞株擴(kuò)大培養(yǎng)并純化抗H5N1病毒的嵌合IgA抗體，用專一性結(jié)合人源抗體Kappa鏈的蛋白L親和層析柱從含有牛血清的CHO細(xì)胞培養(yǎng)上清中純化重組人源抗H5N1-HA IgA抗

6、體，并進(jìn)行免疫學(xué)特性的分析。同時將構(gòu)建的pEF-IGHA9、pEF-IGK9、pcDNA3.1(+)-SC和pcDNA3.1(+)-IgJ表達(dá)質(zhì)粒瞬時共轉(zhuǎn)染CHO/dhfr細(xì)胞，培養(yǎng)48-72 h的細(xì)胞上清，使剛ELISA檢測嵌合SIgA抗體各組分的分泌情況。 綜上所述，本研究成功克隆了人IGHA2、IGJ和pIgR/SC基因以及抗H5N1病毒中和性單抗的V區(qū)基因，并對該V區(qū)基因序列進(jìn)行胚系基因片段的分析；獲得了完整人-鼠嵌合I