抗HBsAg抗體在CHO細(xì)胞中表達(dá)量提高研究——抗體基因自身因素對(duì)表達(dá)量影響探索.pdf

1、基因工程抗體由于其特異性強(qiáng)、副作用低等特點(diǎn)在臨床上將發(fā)揮越來越重要的作用，如應(yīng)用于抗癌、免疫相關(guān)疾病等治療。據(jù)統(tǒng)計(jì)在2010年前將有超過100種抗體應(yīng)用于臨床?？贵w工程研究中有兩個(gè)難點(diǎn)：一是抗體的人源化，以解決影響抗體的HAMA問題；二是抗體的大規(guī)模表達(dá)，即生產(chǎn)足夠量的抗體以供臨床應(yīng)用。隨著抗體工程研究的深入，前者已經(jīng)不成問題，如利用Xenogene小鼠可以產(chǎn)生高度特異的完全人源性單克隆抗體；而后者卻因?yàn)閷?duì)真核細(xì)胞復(fù)雜的表達(dá)調(diào)控機(jī)制認(rèn)識(shí)

2、不充分而存在困難，目前由細(xì)胞工程生產(chǎn)的抗體價(jià)格昂貴(平均US$200/100mg)，影響其應(yīng)用，所以如何提高抗體的表達(dá)量，降低成本，是當(dāng)前迫切的要求。 影響抗體表達(dá)量的因素從總體上來看主要有三個(gè)方面，即抗體表達(dá)載體構(gòu)建、宿主細(xì)胞選擇和改造、細(xì)胞規(guī)模培養(yǎng)和生產(chǎn)工藝。其中表達(dá)載體構(gòu)建是核心技術(shù)，包括通用載體的構(gòu)建和對(duì)抗體基因本身的優(yōu)化。本室以往的研究已經(jīng)對(duì)基于CHO/dhfr-的表達(dá)系統(tǒng)進(jìn)行了比較深入的研究，例如構(gòu)建了一系列行之有效

3、的蛋白質(zhì)表達(dá)載體。本研究利用本室現(xiàn)有的抗HBsAg抗體作為模型蛋白，對(duì)影響抗體表達(dá)量的抗體基因自身因素進(jìn)行分析，以供抗體表達(dá)系統(tǒng)構(gòu)建時(shí)抗體基因設(shè)計(jì)提供參考。 首先采用倉鼠的密碼子偏性對(duì)輕鏈基因進(jìn)行改造，目的是解決在翻譯過程中因CHO細(xì)胞中稀有密碼子產(chǎn)生的蛋白質(zhì)合成速度瓶頸。在設(shè)計(jì)了去除稀有密碼子的輕鏈基因序列后，用合成寡核苷酸序列的方法，PCR拼接合成了優(yōu)化的輕鏈序列，并且構(gòu)建了其真核表達(dá)載體，采用和克隆于高效表達(dá)載體的重鏈基因

4、共轉(zhuǎn)染的方法，在CHO細(xì)胞中表達(dá)。結(jié)果表明，瞬時(shí)表達(dá)和克隆化細(xì)胞表達(dá)時(shí)優(yōu)化后序列和原序列差異不顯著，說明抗體在較低水平(表達(dá)蛋白量占細(xì)胞總蛋白質(zhì)量的0.1-0.5％)表達(dá)時(shí)，稀有密碼子的利用度還不構(gòu)成蛋白質(zhì)合成的瓶頸。由于異源蛋白在大腸桿菌和酵母細(xì)胞中表達(dá)時(shí)，稀有密碼子的改造能大幅度提升表達(dá)量，以及有CHO細(xì)胞表達(dá)EPO(促紅細(xì)胞生產(chǎn)素)人源性優(yōu)化密碼子后表達(dá)量提高的先例，所以我們估計(jì)，在抗體表達(dá)量達(dá)到一定比例后，密碼子優(yōu)化的抗體序列才

5、能有效地發(fā)揮作用。 其次，根據(jù)資料選擇和克隆了3種高效的信號(hào)肽序列，包括倉鼠β-酪蛋白信號(hào)肽序列(+接頭序列)、桿狀病毒p67蛋白信號(hào)肽序列、并對(duì)原有輕鏈信號(hào)肽序列進(jìn)行了優(yōu)化。把各種信號(hào)肽序列替換了原信號(hào)肽序列后，轉(zhuǎn)染CHO細(xì)胞進(jìn)行表達(dá)，結(jié)果其中原有輕鏈信號(hào)肽優(yōu)化的抗體表達(dá)量最高，比原輕鏈表達(dá)載體提高4倍以上，含倉鼠β-酪蛋白信號(hào)肽序列的輕鏈表達(dá)載體提高約2倍，p67蛋白信號(hào)肽在穩(wěn)定表達(dá)的細(xì)胞克隆上也有顯著提高。這些結(jié)果說明，其

6、它類型的蛋白質(zhì)信號(hào)肽序列可以用于抗體表達(dá)，并且無須接頭序列，我們的實(shí)驗(yàn)表明接頭序列反而影響抗體的表達(dá)；還顯示不同的信號(hào)肽序列對(duì)蛋白質(zhì)的表達(dá)效率影響不同。其中原信號(hào)肽基因序列改造后產(chǎn)生的影響可能來源于對(duì)翻譯效率的改善，因?yàn)槠湫盘?hào)肽多肽序列并未改變。 由于抗體基因組序列中包含抗體蛋白質(zhì)表達(dá)調(diào)控元件，所以在第三部分研究中構(gòu)建了抗HBsAg抗體基因組序列。分別克隆了重鏈Fc段基因組序列(包括3'UTR序列)、J/CH雜合內(nèi)含子序列等，并

7、與抗體可變區(qū)序列一起克隆到pcDNA3.1中構(gòu)建表達(dá)載體；同樣，克隆了輕鏈J/Cκ雜合內(nèi)含子和3’UTR序列，并把他們?nèi)诤系皆p鏈cDNA序列中構(gòu)建了真核表達(dá)載體。轉(zhuǎn)染CHO細(xì)胞后表達(dá)結(jié)果表明，輕鏈和重鏈的基因組序列能夠正確剪切，瞬時(shí)表達(dá)時(shí)基因組序列的改善不顯著，但穩(wěn)定表達(dá)克隆中輕鏈基因組序列比cDNA序列表達(dá)效果顯著提高。說明基因組序列能改善抗體的表達(dá)效果，并且此作用不僅是改善了mRNA剪接步驟所致，而更可能是其中的非編碼序列參與表達(dá)

8、調(diào)控的結(jié)果。所構(gòu)建的基因組表達(dá)載體，可以作為通用的嵌合抗體基因組表達(dá)載體，已經(jīng)在多個(gè)嵌合抗體表達(dá)載體構(gòu)建中使用。 抗體基因5’末端非翻譯區(qū)序列也影響其表達(dá)，其中研究得比較清楚的是KOZAK序列，這在原表達(dá)載體中已經(jīng)加入。有資料表明其余5'UTR部分對(duì)蛋白質(zhì)表達(dá)也有影響。為了選擇抗體表達(dá)載體的5'UTR序列，克隆了具有翻譯增強(qiáng)作用的hHsp70基因5'-UTR序列，分別插入到抗體輕、重鏈基因的上游，構(gòu)建表達(dá)載體，在CHO細(xì)胞中表達(dá)

9、，結(jié)果表明，此序列能使重鏈表達(dá)提高約1倍，但對(duì)輕鏈的表達(dá)作用不顯著。 其它方面，還構(gòu)建了用于評(píng)價(jià)抗體基因和表達(dá)元件的Flp-In-CHO/pcDNA5FRT-IRES雙表達(dá)載體，由于此載體能在特定CHO細(xì)胞中以單拷貝方式定點(diǎn)整合到高表達(dá)位點(diǎn)，所以能對(duì)不同序列抗體之間的表達(dá)量差異進(jìn)行更精確的評(píng)價(jià)，用于構(gòu)建抗體基因表達(dá)載體時(shí)選擇合適的序列，實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，該系統(tǒng)表達(dá)HBsAg的表達(dá)量在每一個(gè)穩(wěn)定表達(dá)克隆之間差異不超過40％。此外還進(jìn)行