人源抗HBsAg dsFv抗體靶向干擾素復合基因的克隆和表達.pdf

1、抗體技術經(jīng)歷血清多克隆抗體、單克隆抗體階段后發(fā)展到了第三代抗體-基因工程抗體。我們在前期研究中通過噬菌體抗體庫篩選到人源抗HBsAg基因工程抗體,利用PCR定點突變獲得二硫鍵穩(wěn)定的dsFv(disufide—stabilized Fv fragments)抗體,但抗體的輕鏈與干擾素α的融合基因和重鏈基因分別克隆于pCI—neo和pCdhfrl兩個質粒中,需要共轉染細胞才能獲得表達。本研究擬在此基礎上進一步探索改進,整體思路是將人源抗HB

2、sAgdsFv抗體的輕鏈-干擾素α融合基因和重鏈基因通過自身切割肽F2A連接置于同一開放讀碼框,實現(xiàn)抗體的輕鏈和重鏈在同一質粒中的串聯(lián)表達。
　　 首先在過渡載體pCI—GPI中構建抗體靶向干擾素復合基因:即通過重疊延伸PCR法將dsFv抗體重鏈基因Ⅷ的3’端融入一段帶正電荷的DNA負載區(qū)基因,使目的蛋白帶正電荷,以結合帶負電的質粒DNA；并在抗體輕鏈-干擾素α融合基因3’端連入6×His標簽,以方便表達蛋白的檢測和純化。通過自

3、身切割肽F2A將人源抗HBsAg dsFv抗體的輕鏈復合基因和重鏈復合基因連接置于同一開放讀碼框,并在過渡載體pCI—GPI中實現(xiàn)輕、重鏈復合基因的連接即得到重組質粒pCIGPI—dsFva pr+。
　　 其次,選擇哺乳動物表達系統(tǒng)和昆蟲細胞／桿狀病毒表達系統(tǒng)分別表達抗體靶向干擾素重組復合基因。即在構建好pCIGPI—dsFva pr+的基礎上,把抗體靶向干擾素復合基因通過酶切和PCR等方法克隆入真核表達載體pEE14.1及桿

4、狀病毒表達系統(tǒng)轉移載體pAcGP67A,從而獲得含抗體靶向干擾素復合基因的重組表達質粒pEE14.1-dsFva pr+和pAcGP67A—dsFva pr+,并分別在哺乳動物細胞CHO-K1和昆蟲細胞Sf9中驗證其表達。此外,我們還把哺乳動物表達系統(tǒng)和昆蟲細胞／桿狀病毒表達系統(tǒng)表達的上清中的目的蛋白分別進行了純化,并對其進行了初步驗證。
　　 總之,含抗體靶向干擾素重組基因的重組質粒的構建及其在哺乳動物表達系統(tǒng)和昆蟲細胞／桿狀