TLR4抗體對Hsp70在自身免疫性內(nèi)耳病中表達的干預(yù)性研究.pdf

1、聽力殘損是一個全球性的醫(yī)學(xué)問題。目前，占人類10％以上的成年人群都患有不同程度的感音神經(jīng)性耳聾(sensorineural hearing loss，SHNL)，而聽力下降隨著年齡的老化而日漸增多。像中國這樣一個發(fā)展中的大國，老齡化人群所占比例會進一步上升，耳聾占人類群體的比例也會進一步升高。我國聽力言語殘疾者約有2700萬人，新生兒聽力障礙的發(fā)病率達1/1000。聽力殘損不僅給患者生理、心理及家庭帶來痛苦，而且對社會經(jīng)濟的發(fā)展也造成了

2、嚴(yán)重的影響。研究發(fā)現(xiàn)，許多感音神經(jīng)性聾與免疫因素有關(guān)，但在臨床工作中常不被重視。突發(fā)性耳聾(sudden deafness,SD)、梅尼埃病、耳硬化癥、慢性中耳炎、顳骨創(chuàng)傷及一些伴發(fā)聽力喪失的全身免疫性疾病都存在內(nèi)耳免疫因素。目前，免疫相關(guān)性內(nèi)耳疾病的名稱有多種，自身免疫性內(nèi)耳疾病(autoimmune inner ear disease，AIED)是其暫定統(tǒng)稱。近十幾年來，該病在世界范圍內(nèi)被報道越來越多，我國也有陸續(xù)報道，但因其流行病

3、學(xué)特點不清，發(fā)病機制亦不明確，故其臨床診斷還十分困難。AIED主要癥狀：進行性、波動性、雙耳或單耳的感音神經(jīng)性聾，可伴耳鳴、眩暈(除外噪音性聾，藥物性聾、外傷性聾、早老性老年性聾等)，血清免疫球蛋白IgG、IgM、補體C3、循環(huán)免疫復(fù)合物等免疫學(xué)參數(shù)變化。國內(nèi)外先后報道，在AIED患者中檢測出了不同的非內(nèi)耳組織特異性抗原：熱休克蛋白70、Raf-1蛋白、Po蛋白、β-肌動蛋白、β-微管蛋白、68KD蛋白、鈣粘蛋白S-100β、II型膠原

4、、層粘連蛋白等。由于發(fā)病機制不清，既沒有確定免疫系統(tǒng)攻擊的內(nèi)耳特異性抗原，又沒有特異性實驗檢查指標(biāo)，故AIED在治療原則上還存在爭議。至今尚未發(fā)現(xiàn)有研究報道證明熱休克蛋白70(heat-shock protein 70,Hsp70)的產(chǎn)生是自身免疫性內(nèi)耳疾病的主要因素，還是一種從屬的關(guān)聯(lián)因素以及Hsp70是怎樣發(fā)揮作用造成內(nèi)耳損傷而引發(fā)AIED的。研究證實，Toll樣受體4(toll-like receptor 4,TLR4)介導(dǎo)Hsp

5、70的信號傳導(dǎo)，誘導(dǎo)hsp70活化NF-kB，啟動相關(guān)靶基因轉(zhuǎn)錄，表達炎性細胞因子及細胞黏附分子(TNF-α,ICAM-1等)，介導(dǎo)炎性反應(yīng)。本課題就此通過建立一種高陽性率的伴聽力損害的自身免疫性內(nèi)耳疾病的動物模型，探討TLR4、Hsp70、及其信號傳導(dǎo)阻斷劑TLR4抗體與實驗性自身免疫性內(nèi)耳病的關(guān)系，闡明TLR4/Hsp70在病因?qū)W上的地位和重要性，并進一步探討其可能的發(fā)病機制，同時也為研制受體阻斷劑，開發(fā)與TLR4有相同靶點的新的抗

6、炎藥物提供理論依據(jù)，為AIED的預(yù)防和臨床治療提供新的治療策略。第一部分自身免疫性內(nèi)耳病動物模型的建立目的：擬建一種高陽性率聽力損害的自身免疫性內(nèi)耳病動物模型，并證實模型建立成功。 方法：提取豚鼠內(nèi)耳膜迷路組織，采用制備性SDS-PAGE從內(nèi)耳組織中分離、純化Hsp70蛋白，豚鼠經(jīng)過環(huán)鱗酰胺預(yù)處理后，以純化的豚鼠內(nèi)耳Hsp70作為抗原與等量弗氏完全佐劑進行頸、背部、足部皮內(nèi)多點注射接種免疫豚鼠，觀察內(nèi)耳形態(tài)變化；檢測血清抗Hs

7、p70抗體；測定不同時段聽性腦干反應(yīng)(auditory brainstem response，ABR)閾值、血清免疫球蛋白IgG、IgM、C3及循環(huán)免疫復(fù)合物(circle immune complex，CIC)濃度，并觀察內(nèi)耳損傷程度。 結(jié)果：動物免疫后7d，ABR閾值最大程度升高，聽功能下降；血清IgG、C3、CIC明顯升高，這與臨床上AIED患者血清學(xué)檢查結(jié)果一致。在患自身免疫性內(nèi)耳疾病時，組織損傷大多是由Ⅱ、Ⅲ型變態(tài)反應(yīng)

8、引起，可以出現(xiàn)血清IgG、IgM和C3、CIC的升高；血清中檢測到抗hsp70抗體；內(nèi)耳出現(xiàn)炎細胞浸潤，螺旋神經(jīng)節(jié)細胞變性、脫髓鞘改變；免疫后14d與免疫后7d結(jié)果無明顯變化；免疫28d后，上述各值開始降低，聽功能開始好轉(zhuǎn)。 結(jié)論：純化的同種異體hsp70抗原免疫豚鼠后能夠提高ABR閾值，降低聽功能，增加血清IgG、IgM、C3、CIC濃度，表明自身免疫性內(nèi)耳病動物模型建立成功，其中以動物免疫后7d模型建立最為理想。 目

9、的：在自身免疫性內(nèi)耳病動物模型中檢測不同時段模型動物內(nèi)耳TLR4、Hsp70及其誘導(dǎo)產(chǎn)生的NF-kB(P65)、TNF-αICAM-1表達與ABR的關(guān)系，證實ABR值提高與Hsp70、NF-kB(P65)、TNF-α、ICAM-1表達增加正相關(guān)，表明TLR4介導(dǎo)的hsp70信號傳導(dǎo)與自身免疫性內(nèi)耳病的疾病發(fā)展過程正相關(guān)。 方法：從第一部分已知，豚鼠接種免疫后7d內(nèi)耳形態(tài)學(xué)和病理改變最明顯、28d后開始恢復(fù)正常。故選取第一部分接種

10、免疫后7d，28d的模型動物，斷頭處死(處死前行ABR檢測)，提取耳蝸，制作石蠟切片；提取內(nèi)耳總蛋白；采用免疫組織化學(xué)、原位雜交、western blot、ELASA等方法檢測上述指標(biāo)在內(nèi)耳的表達，運用直線相關(guān)方程分析ABR與TLR4/Hsp70的相關(guān)性。 結(jié)果：豚鼠免疫后7d,ABR值最大程度升高，為51.25±3.48dB，聽功能下降最低，內(nèi)耳TLR4、Hsp70、NF-kB(P65)、TNF-α、ICAM-1的表達明顯增加

11、，免疫后28d，ABR值降低，為48.75±3.54dB，豚鼠聽功能開始提高，上述各指標(biāo)的表達也開始下降，ABR與TLR4/Hsp70直線相關(guān)分析呈正相關(guān)。說明內(nèi)耳在同種異體外來抗原的刺激下，發(fā)生免疫應(yīng)答，使內(nèi)耳Hsp70的表達增多；TLR4識別增多的hsp70信號，并介導(dǎo)其信號傳導(dǎo)，活化Hsp70，誘導(dǎo)其激活NF-KB(P65)，調(diào)控和釋放炎癥因子和炎癥介質(zhì)，引發(fā)內(nèi)耳損傷，聽功能亦隨之下降。 結(jié)論：在自身免疫性內(nèi)耳病動物模型中

12、，ABR值與TLR4、Hsp70、NF-KB(P65)、TNF-α、ICAM-1表達均增加，且ABR值隨TLR4/Hsp70表達的增加而升高，直線相關(guān)分析證明兩者呈正相關(guān)。表明TLR4/Hsp70與AlED的疾病發(fā)展過程正相關(guān)。 第三部分鼓室注射TLR4抗體干預(yù)Hsp70在內(nèi)耳表達的作用的研究第一節(jié)鼓室注射不同劑量TLR4抗體干預(yù)Hsp70在內(nèi)耳的動態(tài)表達變化目的：鼓室注射不同劑量TLR4抗體，研究抗體注射時間和注射劑量對內(nèi)耳H

13、sp70的表達，選擇最佳注射時間和抗體注射劑量。 方法：豚鼠免疫后2d、5d、7d，每只耳分別經(jīng)鼓室注射TLR4抗體50、100、150、200、250μg，采用免疫組織化學(xué)、原位雜交、westernblot等方法觀察不同時間不同劑量TLR4抗體對Hsp70在內(nèi)耳的表達變化，從而選擇最佳抗體注射時間和最佳抗體注射劑量。 結(jié)果：豚鼠免疫后2d，注射50、100、150、200、250μg TLR4抗體，7d后內(nèi)耳Hsp70

14、的表達逐漸降低，而200μg與250μg劑量使Hsp70表達變化不明顯；豚鼠免疫后5d、7d，鼓室注射TLR4抗體干預(yù)hsp70表達的能力逐漸降低，但均發(fā)現(xiàn)200μg劑量TLR4抗體能最大程度干預(yù)Hsp70在內(nèi)耳的表達，故選擇豚鼠免疫后2d，鼓室注射TLR4抗體200μg為最佳抗體注射時間和最佳抗體注射劑量。 結(jié)論：在豚鼠免疫后2d，每只耳經(jīng)鼓室注射TLR4抗體200μg，可最大程度干預(yù)Hsp70在內(nèi)耳的表達。第二節(jié)TLR4抗體

15、干預(yù)后NF-κB(P65)、TNF-α、ICAM-1、在內(nèi)耳的表達變化及意義目的：觀察鼓室注射TLR4抗體后內(nèi)耳NF-κB(P65)、TNF-α、ICAM-1的表達變化，并進一步探討其可能的病因?qū)W機制。 方法：將動物隨機分為實驗組、干預(yù)組和對照組，聯(lián)合早期實驗結(jié)果，模型動物免疫后2d，干預(yù)組施加干預(yù)因素：每只耳經(jīng)鼓室注射TLR4抗體200μg，7d后，每組動物行ABR檢測，然后處死動物，采用免疫組織化學(xué)、原位雜交、western

16、 blot、ELISA等方法檢測各組動物內(nèi)耳ICAM-1、NF-κB(P65)、TNF-α的表達。 結(jié)果：動物免疫后7d，豚鼠ABR明顯升高，內(nèi)耳ICAM-1、NF-κB(P65)、TNF-α呈高表達；給予TLR4抗體干預(yù)后，內(nèi)耳NF-κB(P65)、TNF-α、ICAM-1表達明顯降低，豚鼠ABR閾值降低，聽功能提高。推測鼓室注射TLR4抗體后，與TLR4發(fā)生抗原抗體結(jié)合反應(yīng)，阻斷了TLR4介導(dǎo)的Hsp70信號傳導(dǎo)通路，使Hs

17、p70活性下降和誘導(dǎo)NF-κB(P65)活化轉(zhuǎn)錄的功能減弱，從而使NF-κB(P65)調(diào)控、誘導(dǎo)產(chǎn)生的炎癥因子和炎癥介質(zhì)減少，內(nèi)耳損傷減輕。 結(jié)論：鼓室注射TLR4抗體，能抑制Hsp70基因mRNA和蛋白在內(nèi)耳的表達，提高聽功能；減少炎癥因子和炎癥介質(zhì)的釋放，減輕內(nèi)耳炎癥反應(yīng)。提示TLR4/Hsp70在AIED發(fā)病中可能起主要作用，它可能是AIED發(fā)病的主要機制之一，并為進一步研發(fā)受體阻斷劑，從而在源頭控制炎癥反應(yīng)提供理論依據(jù)，