抗KDR抗體基因克隆及其Fab樣基因工程抗體表達載體的構(gòu)建及表達研究.pdf

1、臨床腫瘤治療失敗的主要原因之一是腫瘤發(fā)生侵襲和轉(zhuǎn)移，怎樣才能阻斷腫瘤的轉(zhuǎn)移已成為腫瘤治療的基礎(chǔ)和臨床研究的熱點課題之一。近幾十年來，大量研究結(jié)果證實腫瘤的增殖、侵襲和轉(zhuǎn)移與腫瘤的血管新生(angiogenesis)密切相關(guān)，這一發(fā)現(xiàn)極大的促進了該領(lǐng)域的研究開展。近些年來，隨著血管新生相關(guān)機制研究的深入，使得通過抑制腫瘤血管新生來抑制腫瘤生長的理念得到越來越多基礎(chǔ)和臨床研究的證明。 VEGF被認為是在血管生成過程中起中樞調(diào)節(jié)作用的

2、因子，它通過促進血管新生從而促進腫瘤生長和轉(zhuǎn)移?，F(xiàn)已發(fā)現(xiàn)的VEGF受體包括VEGFR-1、-2、-3和NRP-1、NRP-2，其中VEGFR-2(Kinase insertdomain-containing receptor，KDR)作為血管內(nèi)皮細胞生長因子主要受體之一，在內(nèi)皮細胞增殖、遷移、分化、微管形成、血管通透性增加中發(fā)揮重要作用。KDR屬酪氨酸蛋白激酶第Ⅲ亞型，它的胞外區(qū)包括7個免疫球蛋白樣結(jié)構(gòu)域，其中區(qū)域Ⅱ和區(qū)域Ⅲ對與VEGF

3、的相互作用貢獻較大。缺失區(qū)域Ⅲ會引起KDR與VEGF結(jié)合的親和力下降1000倍，因此說明區(qū)域Ⅲ盡管未必直接參與結(jié)合配體，但在VEGF/KDR相互作用中發(fā)揮關(guān)鍵作用。 我們將含有KDR胞外Ⅲ區(qū)基因質(zhì)粒(含有堿性磷酸酶(phoA)啟動子和引導肽stⅡ的分泌型表達載體pAYZ)，在大腸桿菌16C9中獲得了高效分泌可溶性表達。采用三角瓶搖瓶培養(yǎng)。表達產(chǎn)物經(jīng)抗E-tag親和層析純化，獲得純度90％以上的KDR胞外Ⅲ區(qū)融合蛋白。 隨

4、后，基于上述表達出的KDR胞外Ⅲ區(qū)融合蛋白，按照常規(guī)制備雜交瘤的方法，我們制備出一株能穩(wěn)定分泌抗KDR胞外Ⅲ區(qū)單克隆抗體的雜交瘤細胞株YcomlD3。體外生物活性研究表明，該單克隆抗體不僅可與可溶性KDR胞外Ⅲ區(qū)蛋白抗原以及細胞表面表達的KDR結(jié)合，還可競爭性抑制VEGF165與可溶性KDR胞外Ⅲ區(qū)蛋白抗原的結(jié)合，具有潛在的抗腫瘤血管新生臨床應用價值。 為克服鼠源性單抗自身固有的一些缺陷，我們借助基因重組的方法，構(gòu)建出其相對應的

5、Fab樣基因工程抗體，即通過采用通用簡并性引物，成功克隆了抗KDR單克隆抗體Ycom1D3輕、重鏈可變區(qū)基因，爾后，將VL、VH基因分別克隆到含有人IgG1 CL和CH1的中間載體pB11和pB12上，然后再通過酶切將獲得的VL+CL和VH+CH1基因重組到載體pA19，構(gòu)建成抗KDR Fab樣抗體片段表達載體pAYZKDRFab，并在大腸桿菌中獲得了表達。ELISA實驗表明該基因工程抗體保留了親本單克隆抗體的特異性結(jié)合活性，并可競爭性