人源抗hTLR4基因工程抗體Fab片段的制備及生物特性鑒定.pdf

1、研究目的：TLR4受體是一種模式識別受體，在對TLR4的研究中發(fā)現(xiàn)，TLR4在LPS介導的嚴重反應中起著關鍵的調(diào)節(jié)作用。TLR4通過依賴MyD88途徑或不依賴MyD88途徑調(diào)節(jié)LPS在細胞內(nèi)的信號傳導，從而控制內(nèi)毒素發(fā)揮生物學效應。阻斷TLR4介導的內(nèi)毒素信號向細胞內(nèi)的傳導，是減輕內(nèi)毒素生物學效應的有效的方法。本課題在上一階段的研究中成功制備出了鼠抗人TLR4單克隆抗體，體外活性檢測顯示其能顯著抑制經(jīng)LPS刺激TNF-α的產(chǎn)生。但鼠源單

2、克隆抗體在人體治療中易出現(xiàn)人抗鼠抗體（HAMA）反應。嵌合抗體技術是將人源抗體恒定區(qū)替代鼠抗體的恒定區(qū)，構建人鼠嵌合抗體，不僅可以保留親本抗體的高親和力，而且大大降低鼠單克隆抗體在人體應用中的免疫原性。本研究在嵌合抗體技術的基礎上，針對人源抗TLR4抗體設計合成抗TLR4抗體Fab片段基因，利用重疊延伸法擴增Fab片段基因，構建表達質(zhì)粒并轉(zhuǎn)化大腸桿菌，探索其原核表達，以期獲得有效的抗TLR4抗體Fab片段。
　　研究方法：

3、　　1.制備人源抗TLR4抗體Fab片段利用PCR技術從本課題上一階段篩選的陽性噬菌體中擴增抗體重鏈可變區(qū)VH和輕鏈可變區(qū)VL基因，采用重疊擴展延伸法成功將人源抗體恒定區(qū)重鏈與輕鏈分別與噬菌體擴增的可變區(qū)重鏈和輕鏈拼接，獲得重組重鏈Fd和輕鏈；進一步構建重組質(zhì)粒pETDuetTM-1-Fab；轉(zhuǎn)化大腸桿菌BL21誘導表達，獲得高純度的人源抗TLR4抗體Fab片段。
　　2.鑒定Fab抗體與抗原的相互作用及測定抗體親和常數(shù)采用流式細

4、胞儀及BiacoreX100儀分別檢測抗TLR4抗體 Fab片段特異性識別TLR4抗原的能力及抗體的親和力。
　　3.抗體體外中和試驗體外中和實驗檢測抗TLR4抗體Fab片段對炎癥因子TNF-α的中和作用。
　　研究結果：
　　1.成功擴增獲得重組重鏈Fd和輕鏈DNA片段；構建重組原核表達質(zhì)粒pETDuetT-1-Fab；轉(zhuǎn)入大腸桿菌誘導表達后，親和純化獲得高純度的抗TLR4抗體Fab片段。
　　2. ELISA

5、及流式細胞儀檢測結果顯示，本研究中所制備的抗體能夠與hTLR4特異性結合。
　　3.本研究中所制備的抗TLR4抗體Fab片段親和常數(shù)為1.619*10-7。
　　4.人源抗TLR4抗體Fab片段在體外可有效的保護細胞，中和腫瘤壞死因子TNF-α。
　　結論：
　　本研究成功制備人源抗TLR4抗體Fab片段，該抗體可與hTLR4特異性結合，親和力較高，在體外可有效中和腫瘤壞死因子TNF-α，保護細胞。表明通過基因工