鼻咽癌人源抗獨(dú)特型基因工程抗體的原核表達(dá)及其生物活性研究.pdf

1、目的：構(gòu)建鼻咽癌人源抗獨(dú)特型抗體基因原核表達(dá)載體pET25b(+)-G22，用原核系統(tǒng)表達(dá)出抗獨(dú)特型基因工程抗體，并進(jìn)行動(dòng)物實(shí)驗(yàn)，為抗鼻咽癌疫苗的制備奠定基礎(chǔ)。 方法：PCR擴(kuò)增G22 ScFv基因，重組至原核表達(dá)載體pET25b(+)中，構(gòu)建重組表達(dá)載體并將其轉(zhuǎn)化入大腸桿菌BL21(DE3)。通過摸索誘導(dǎo)表達(dá)條件來提高目的基因的原核表達(dá)水平和可溶性融合蛋白的含量。將提取的可溶性和包涵體形式的G22 ScFv蛋白經(jīng)His-tag

2、磁珠蛋白純化試劑盒純化。包涵體形式的重組蛋白經(jīng)初步洗滌純化后，溶于8M尿素溶液中再用磁珠純化，然后用稀釋法復(fù)性。SDS-PAGE分析蛋白純度，用Western blot方法和不連續(xù)非變性凝膠電泳檢測(cè)表達(dá)的融合蛋白活性。將純化的G22 ScFv蛋白作為抗原接種于BALB／c小鼠背部皮下，共免疫4次，免疫完后分4批取小鼠血清，然后處死小鼠取其脾臟，制備單個(gè)脾細(xì)胞懸液。用間接ELISA、競(jìng)爭(zhēng)抑制ELISA測(cè)血清抗體，用流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)免疫鼠脾細(xì)

3、胞的CD4<'+>、CD8<'+>表型變化。 結(jié)果：酶切和序列分析表明重組至表達(dá)載體pET25b(+)的基因與G22 ScFv基因一致。重組蛋白在原核細(xì)胞中以可溶和不可溶兩種表達(dá)形式存在，但以不溶的包涵體形式為主。低溫(30℃)能利于可溶性G22 ScFv融合蛋白的產(chǎn)生，而1mM濃度的IPTG誘導(dǎo)5小時(shí)，蛋白總產(chǎn)量可達(dá)最高。包涵體形式的G22 ScFv經(jīng)2％脫氧膽酸鈉的初步洗滌，可除去大量的細(xì)菌雜蛋白。用His-tag磁珠純化G

4、22 ScFv，經(jīng)SDS-PAGE電泳檢測(cè)純度可達(dá)95％以上。用含有甘油、精氨酸、氧化型和還原型谷胱甘肽的復(fù)性緩沖液可利于包涵體的復(fù)性。經(jīng)Western Blot證實(shí)G22 ScFv具有抗原特異性：非變性PAGE電泳說明復(fù)性后的包涵體有生物活性。融合蛋白免疫小鼠后可誘導(dǎo)產(chǎn)生Ab3，產(chǎn)生的Ab3能競(jìng)爭(zhēng)性抑制FC2 McAb(針對(duì)鼻咽癌的單抗)與鼻咽癌細(xì)胞HNE2表面抗原的結(jié)合；并可刺激小鼠的脾細(xì)胞CD4<'+>T細(xì)胞、CD8<'+>T細(xì)胞