基于抗獨特型納米抗體的桔霉素綠色免疫分析的研究.pdf

1、桔霉素（Citrinin,CIT）是由青霉屬（Penicillium）、曲霉屬（Aspergillus）和紅曲霉屬（Monascus）中的絲狀霉菌代謝產(chǎn)生的一種真菌毒素，對人和動物具有較強(qiáng)的毒性作用。廣泛存在于糧谷類及紅曲發(fā)酵制品等食物中。鑒于桔霉素在各類食品中的污染水平及居民膳食中的暴露量，部分國家已制定了紅曲制品中CIT的限量標(biāo)準(zhǔn)。目前，應(yīng)用于檢測CIT的方法主要包括薄層層析法、高效液相色譜法、免疫分析法以及電化學(xué)傳感器等。相比較而

2、言，免疫分析法基于抗原抗體特異性識別，具有檢測靈敏度高、選擇性好、樣品前處理簡單、耗時短、成本低等優(yōu)勢。適合于食品安全監(jiān)測過程中的大樣本快速篩檢。然而該方法的建立與應(yīng)用，需使用大量CIT標(biāo)準(zhǔn)物及有機(jī)溶劑合成檢測抗原，同時還需CIT標(biāo)準(zhǔn)物建立標(biāo)準(zhǔn)曲線，對操作人員的健康具有潛在的危害。若含有毒素標(biāo)準(zhǔn)物的廢液處理不當(dāng)，還可能造成實驗室及環(huán)境的二次污染問題。本研究針對上述問題，將抗獨特型納米抗體應(yīng)用于CIT的分子模擬，研制出CIT替代抗原，并建

3、立了CIT綠色免疫學(xué)分析技術(shù)，降低了CIT對操作人員的危害及對環(huán)境造成的污染，為CIT污染的監(jiān)控提供了靈敏、快速、簡便、成本低、環(huán)保的新方法。本論文的主要研究內(nèi)容和創(chuàng)新點如下：
　　1首次從羊駝天然納米抗體文庫中淘選獲得CIT替代抗原的抗獨特型納米抗體，研究建立了基于納米抗體替代抗原的免疫分析技術(shù)，為其他小分子生物毒素等毒性污染物的綠色免疫分析研究提供了新的技術(shù)平臺。
　　1.1CIT噬菌體ELISA方法的建立（P-ELIS

4、A）。經(jīng)過四輪親和淘選，從羊駝天然納米抗體文庫中獲得一株可與CIT單克隆抗體4G6可變區(qū)特異性結(jié)合的納米抗體X27，并建立了噬菌體展示納米抗體作為替代競爭抗原的ELISA。對包被抗體濃度、噬菌體投入量、甲醇濃度、pH值、鹽離子濃度等參數(shù)的優(yōu)化后。該方法對CIT檢測的IC50值為10.9ng/mL，線性范圍為2.5~100.0μg/kg，與常見真菌毒素黃曲霉毒素B1（AFB1）、赭曲霉毒素A（OTA）、玉米赤霉烯酮（ZEN）和脫氧雪腐鐮刀

5、菌烯醇（DON）無交叉反應(yīng)；對大米和面粉兩種空白樣品加標(biāo)回收率分別在82.0~100.3％和79.2~110.1%之間；對谷類樣品進(jìn)行檢測，與傳統(tǒng)ELISA比較，檢測結(jié)果一致。
　　1.2基于納米抗體替代包被抗原ELISA方法的建立（V-ELISA）。對X27納米抗體進(jìn)行表達(dá)純化。該抗體可特異性結(jié)合CIT抗體4G6，與其他抗真菌毒素抗體無交叉反應(yīng)；經(jīng)棋盤滴定優(yōu)化了納米抗體包被濃度和抗體工作濃度，建立了以X27納米抗體為包被抗原的V

6、-ELISA方法，并對反應(yīng)體系的甲醇濃度進(jìn)行了優(yōu)化。該方法對CIT檢測的IC50值為44.6ng/mL，線性范圍為5.0~300.0μg/kg，方法與四種常見真菌毒素（AFB1、OTA、ZEN、DON）無交叉反應(yīng)；大米和面粉兩種空白樣品加標(biāo)回收率分別在82.7~101.5%和83.7~115.6%之間；分別采用V-ELISA與傳統(tǒng)ELISA對紅曲發(fā)酵大米樣品進(jìn)行檢測，兩種方法檢測結(jié)果一致，表明本研究建立的基于納米抗體替代包被抗原的ELI

7、SA方法可應(yīng)用于紅曲制品中CIT的污染監(jiān)測。
　　1.3抗原抗體結(jié)合動力學(xué)參數(shù)的分析。采用生物薄膜光干涉技術(shù)（BLI）分別對X27納米抗體與CIT抗體4G6及CIT人工合成抗原與抗體的結(jié)合動力學(xué)參數(shù)進(jìn)行測定。CIT模擬抗原X27納米抗體與抗體的平衡解離常數(shù)KD值為160nM，而CIT人工合成抗原的KD值為68nM?；贑IT模擬抗原較低的親和力，V-ELISA展示出比傳統(tǒng)ELISA更高的靈敏度。
　　2成功構(gòu)建雙峰駱駝天然納

8、米抗體文庫，并將淘選獲得的不同親和力的抗獨特型納米抗體分別作為CIT標(biāo)準(zhǔn)物替代品和CIT包被抗原，研究建立了基于納米抗體的無毒免疫分析方法。
　　2.1成功構(gòu)建雙峰駱駝天然納米文庫。提取未經(jīng)免疫的雙峰駱駝外周血淋巴細(xì)胞RNA，采用單域重鏈抗體鉸鏈區(qū)特異性引物，克隆獲得大小在500bp左右的重鏈可變區(qū)片段（VHH）。再將擴(kuò)增得到的VHH片段連接到噬菌粒載體pHEN1上，電轉(zhuǎn)化大腸桿菌TG1，獲得庫容量為5.0×108的駱駝天然納米抗

9、體基因文庫，經(jīng)M13K07輔助噬菌體救援獲得滴度為1.2×1013c.f.u/mL的納米抗體噬菌體展示庫。
　　2.2以抗CIT單克隆抗體4G6為靶標(biāo)進(jìn)行固相親和淘選。采用Gly-HCl(pH2.2)洗脫法結(jié)合CIT標(biāo)準(zhǔn)物競爭洗脫法，對駱駝天然納米抗體親和淘選。獲得5種不同序列的克隆可與CIT競爭結(jié)合CIT單克隆抗體4G6。5種納米抗體展現(xiàn)出不同的親和力，其中C1與CIT抗體4G6的親和力最高，KD值為38.4nM。此外，納米抗體

10、C1在70℃下處理20min仍保持良好活性，具有較高的熱穩(wěn)定性。
　　2.3基于抗獨特型納米抗體的無毒ELISA方法的建立。以納米抗體A9為包被抗原，分別建立CIT標(biāo)準(zhǔn)物及納米抗體C1替代CIT標(biāo)準(zhǔn)物的標(biāo)準(zhǔn)曲線。在相同的抑制率下，納米抗體C1濃度與CIT標(biāo)準(zhǔn)物濃度具有良好的線性相關(guān)，線性相關(guān)方程為y=49.404x-10.395（R2=0.9977），其中y為CIT濃度，x為納米抗體C1濃度。采用兩步法計算樣品中CIT含量，首先根