花狀納米金及抗獨(dú)特型納米抗體在真菌毒素免疫學(xué)檢測(cè)中的應(yīng)用研究.pdf

1、真菌毒素為產(chǎn)毒真菌產(chǎn)生的一類次級(jí)代謝產(chǎn)物，廣泛存在于自然界，可經(jīng)由污染的農(nóng)產(chǎn)品和食品對(duì)人畜的健康產(chǎn)生嚴(yán)重危害，嚴(yán)重時(shí)可導(dǎo)致癌癥甚至喪命，其中尤以黃曲霉毒素B1(Aflatoxin B1，AFB1)和赭曲霉毒素A(Ochratoxin，OTA)毒性較大，因此建立快速、靈敏且特異性的檢測(cè)方法顯得尤為重要。在檢測(cè)方法中，免疫學(xué)檢測(cè)方法因具有靈敏度高、特異性強(qiáng)且簡(jiǎn)單方便等優(yōu)點(diǎn)是目前常用的真菌毒素檢測(cè)方法，但隨著我國(guó)農(nóng)產(chǎn)品及食品進(jìn)出口貿(mào)易的增加，

2、人們對(duì)其質(zhì)量和安全的要求愈來愈高，普通的免疫學(xué)檢測(cè)方法已經(jīng)難以滿足人們對(duì)真菌毒素高靈敏性和特異性的要求，因此建立高靈敏和高特異性的真菌毒素免疫學(xué)檢測(cè)方法勢(shì)在必行。
　　本論文以建立高靈敏性和特異性的免疫學(xué)分析方法為目的，從檢測(cè)信號(hào)及免疫學(xué)識(shí)別元件兩個(gè)方面對(duì)AFB1和OTA進(jìn)行新型分析方法的研究。首先合成了具有高光學(xué)性質(zhì)及穩(wěn)定性的花狀納米金(Gold nanoflowers,AuNFs)，以其作為新型標(biāo)記探針，建立了AFB1高靈敏的

3、免疫層析檢測(cè)技術(shù)；同時(shí)，從羊駝天然納米抗體文庫(kù)中淘選得到OTA抗獨(dú)特型納米抗體(anti?idiotypic nanobody，AId-Nb)，以其取代傳統(tǒng)的化學(xué)合成抗原，建立了高靈敏的環(huán)境友好型OTA分析方法。主要研究?jī)?nèi)容包括：
　　1.以對(duì)苯二酚作為還原劑，通過種子介導(dǎo)生長(zhǎng)法，合成高質(zhì)量的AuNSs和AuNFs。通過改變種子、氯金酸及對(duì)苯二酚的添加量，對(duì)AuNSs和AuNFs的合成條件進(jìn)行初步探索，并通過透射電子顯微鏡、紫外-

4、可見光-近紅外分光光度儀和 Zeta電位等表征手段對(duì)納米金的形貌、光學(xué)性質(zhì)及穩(wěn)定性進(jìn)行表征。結(jié)果顯示，種子的添加量為影響粒徑大小的主要因素，即隨著種子添加量的減少，納米金的粒徑顯著增大，并且表面粗糙程度增加，可逐漸形成AuNFs，當(dāng)種子的加入體積≤500μL時(shí)生成 AuNFs；反應(yīng)速率為影響形貌的主要因素，即降低氯金酸添加量(≤150μL)或增加對(duì)苯二酚添加量(300μL≤V≤400μL)均可生成AuNFs。75 nm AuNFs的吸光

5、度是75 nm AuNSs的吸光度的1.5倍，表明相同粒徑的AuNFs不僅具有更強(qiáng)的光學(xué)特性，而且穩(wěn)定。
　　2.以AuNFs作為新型標(biāo)記探針，建立AFB1的免疫層析試紙條定量檢測(cè)方法。通過抗AFB1單克隆抗體與AuNFs偶聯(lián)，以檢測(cè)線（T線）吸光值與質(zhì)控線（C線）吸光值的比值(ODT/ODC)進(jìn)行定量。對(duì)大米樣品進(jìn)行檢測(cè)，并與傳統(tǒng)ELISA方法進(jìn)行結(jié)果對(duì)比。結(jié)果顯示，當(dāng)AFB1濃度在0.5～25 pg/mL范圍內(nèi)，具有較好的線性

6、，且50％抑制濃度(IC50)達(dá)到4.17 pg/mL(n=5)，最低檢測(cè)限為0.32 pg/mL，較傳統(tǒng)的AuNSs試紙條的靈敏度提高了10倍。批內(nèi)及批間變異系數(shù)均小于15%。采用該試紙條和商業(yè)化ELISA試劑盒分別分析50份陰性加標(biāo)大米樣品，兩者的結(jié)果具有較好的線性相關(guān)性(R2=0.93)。以AuNFs作為標(biāo)記探針建立免疫層析檢測(cè)方法，具有較好的靈敏度，且具有較廣闊的商業(yè)化應(yīng)用前景。
　　3.以抗OTA單克隆抗體為靶分子，采用

7、“1輪酸洗脫+3輪競(jìng)爭(zhēng)洗脫”的策略，從羊駝天然納米抗體噬菌體文庫(kù)中親和淘選與之結(jié)合的AId-Nb噬菌體，并建立實(shí)時(shí)熒光定量免疫PCR(Q-IPCR)。經(jīng)淘選得到一株 OTA-AId-Nb噬菌體克隆，并基于該噬菌體建立了ELISA標(biāo)準(zhǔn)曲線，IC50為300 pg/mL，靈敏度較基于傳統(tǒng)化學(xué)合成抗原的ELISA提高了8.83倍。進(jìn)一步構(gòu)建Q-IPCR，其最低檢測(cè)限為4.17 pg/mL，比以噬菌體構(gòu)建的ELISA方法靈敏度提高了9倍。實(shí)際谷

8、物中的Q-IPCR檢測(cè)結(jié)果與商業(yè)化ELISA試劑盒檢測(cè)結(jié)果具有較好的相關(guān)性?；贏Id-Nb的環(huán)境友好型的Q-IPCR檢測(cè)方法為小分子有毒有害污染物的檢測(cè)提供了新的方法。
　　4.以O(shè)TA-AId-Nb噬菌體特異性基因構(gòu)建重組表達(dá)載體并將其轉(zhuǎn)入E.coli Rosetta(DE3)中表達(dá)。以O(shè)TA-AId-Nb取代化學(xué)合成抗原，建立了環(huán)境友好型ELISA及免疫層析試紙條法。將OTA-AId-Nb作為包被抗原建立ELISA，線性范圍