2023年全國(guó)碩士研究生考試考研英語(yǔ)一試題真題(含答案詳解+作文范文)_第1頁(yè)
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1、背景:T-2毒素屬于單端孢霉烯族化合物中的A族,是該類化合物中毒性最強(qiáng)、污染水平較高的毒素之一,主要是由三線鐮刀菌,梨孢鐮刀菌,擬枝孢鐮刀菌和木賊鐮刀菌等霉菌產(chǎn)生。T-2毒素主要污染小麥、玉米、大麥、燕麥和黑麥等谷物及麥芽、啤酒和面包等農(nóng)產(chǎn)品。關(guān)于T-2毒素污染情況的報(bào)道,大多集中于對(duì)谷物和飼料的調(diào)查。據(jù)文獻(xiàn)報(bào)道,T-2毒素在各洲的谷物中廣泛存在。國(guó)內(nèi)報(bào)道在大骨節(jié)病區(qū)小麥、玉米及非病區(qū)小麥、大米中均有檢出。結(jié)合國(guó)外資料,認(rèn)為T-2毒素在

2、全世界不同地區(qū),對(duì)不同谷物均有一定程度的污染。 在動(dòng)物實(shí)驗(yàn)中,T-2毒素對(duì)動(dòng)物顯示了比較明確的免疫毒性及血液毒性,可抑制DNA、RNA及蛋白質(zhì)合成,誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡,引起白細(xì)胞缺乏等。人類誤食了大量污染該類毒素的谷物后,除表現(xiàn)嘔吐、腹痛、腹瀉等急性癥狀外,可有白細(xì)胞缺乏,壞死性咽峽炎,骨髓發(fā)育不良,食管和胃嚴(yán)重壞死等,病死率高(死亡率高達(dá)50%-60%)。二戰(zhàn)期間前西伯利亞阿穆?tīng)柕貐^(qū),數(shù)千人因進(jìn)食了被鐮刀菌污染的越冬小麥而發(fā)生食物中

3、毒,在后來(lái)的產(chǎn)毒試驗(yàn)中,發(fā)現(xiàn)了高水平的T-2毒素;我國(guó)的安徽、河南兩省在1991年因洪澇災(zāi)害而引起霉變小麥中毒,當(dāng)時(shí)在采集的48份樣品中,47份均檢出T-2毒素,平均含量在255.9~671.6ppb之間,最高值可達(dá)1064.6ppb。此外,T-2毒素還與我國(guó)某些地區(qū)食管癌、克山病和大骨節(jié)病的高發(fā)病率有著密切的關(guān)系。近幾十年,T-2毒素還被作為生物戰(zhàn)劑用于戰(zhàn)爭(zhēng)中。 目前,檢測(cè)糧谷類食品和飼料中T-2毒素的方法主要有薄層色譜法(T

4、LC)、液相色譜法(LC)、氣相色譜法(GC)、氣質(zhì)聯(lián)用(GC-MS)、酶聯(lián)免疫吸附測(cè)定法(ELISA)等。TLC法用目測(cè)半定量,靈敏度不高,也不適用于檢測(cè)大量樣品的實(shí)際需要,也缺乏選擇性和敏感性,近年來(lái)應(yīng)用較少。LC、GC是定量的檢測(cè)方法,結(jié)果準(zhǔn)確可靠,但缺點(diǎn)是檢出限較高,而且所用儀器設(shè)備較為昂貴。ELISA法是一種準(zhǔn)確、可靠、快速、特異的檢測(cè)方法,適合于大樣品的快速篩選,我國(guó)1992年申報(bào)的國(guó)標(biāo)GB/T5009.118-2003規(guī)定

5、的方法為ELISA檢測(cè)法。 但是,在ELISA法檢測(cè)過(guò)程中存在一問(wèn)題,就是必須接觸大量高濃度的T-2毒素標(biāo)準(zhǔn)品,檢測(cè)人員長(zhǎng)期接觸具有潛在的危險(xiǎn)性。除此以外,T-2毒素標(biāo)準(zhǔn)品價(jià)格昂貴,檢測(cè)成本較高。而一種新型的免疫試劑——抗獨(dú)特型抗體,因其在空間構(gòu)象上與T-2毒素抗原存在著所謂“內(nèi)影象”關(guān)系,所以有望作為T-2毒素的替代品用于免疫學(xué)檢測(cè),從而實(shí)現(xiàn)T-2毒素的無(wú)毒檢測(cè),并降低成本。 目的:通過(guò)制備T-2毒素抗獨(dú)特型抗體,替代

6、免疫檢測(cè)中毒素標(biāo)準(zhǔn)品,從而建立無(wú)毒ELISA檢測(cè)體系,用于我國(guó)糧谷中的T-2毒素的檢測(cè)。 方法:1采用雜交瘤技術(shù)建立分泌抗T-2毒素的單克隆抗體的雜交瘤細(xì)胞系,采用小鼠體內(nèi)誘生單克隆抗體的方法生產(chǎn)單克隆抗體,用酶聯(lián)免疫吸附法進(jìn)行單克隆抗體特性鑒定。 2采用無(wú)花果蛋白酶酶切法大量制備單克隆抗體F(ab')2片段,使用快速蛋白純化儀(FPLC)進(jìn)行分離純化,用酶聯(lián)免疫吸附法進(jìn)行F(ab')2片段特性鑒定。 3利用片段

7、或片段聯(lián)接物免疫家兔,制備T-2毒素抗獨(dú)特型多克隆抗體,用酶聯(lián)免疫吸附法進(jìn)行多克隆抗體特性鑒定。 4利用所生產(chǎn)的抗獨(dú)特型多克隆抗體制備無(wú)毒ELISA定量測(cè)定試劑盒,并對(duì)其相關(guān)技術(shù)參數(shù)進(jìn)行初步研究。 結(jié)果:1采用雜交瘤細(xì)胞克隆法建立了一株分泌抗T-2毒素單克隆抗體的雜交瘤細(xì)胞株(命名為T4F2)。 2抗體特性經(jīng)鑒定,抗體亞類為IgG1型為主,兼有IgG2a、IgG3;抗體腹水效價(jià)為1:3.2×106;分子量為150

8、KD;參考工作濃度為1:1×105;純化后抗體IgG含量為6.5mg/ml,共360mg;抗體與其它結(jié)構(gòu)類似物無(wú)交叉反應(yīng)(交叉反應(yīng)率<1%);抗體親和力常數(shù)為1.63×10-9mol/L;對(duì)T-2毒素最低檢出濃度為0.5ng/ml;T-2毒素50%抑制濃度29.05ng/ml;線性范圍0.5~160.72ng/ml。 3采用無(wú)花果蛋白酶酶切法得到單克隆抗體F(ab')2片段,抗體片段特性經(jīng)鑒定,分子量為105kD;參考工作濃度為

9、1:5×103;抗體F(ab')2片段濃度1.291mg/ml;抗體親和力常數(shù)為8.51×10-10mol/L;對(duì)T-2毒素最低檢出濃度為0.5ng/ml;20%T-2毒素抑制濃度3.24ng/ml;50%T-2毒素抑制濃度27.84ng/ml;80%T-2毒素抑制濃度144.54ng/ml;線性范圍0.5-176.38ng/ml。 4用抗體F(ab')2片段免疫家兔得到T-2毒素抗獨(dú)特型多抗,抗體特性經(jīng)鑒定,抗體亞類為Ab2β

10、型;分子量為150KD;抗體與其它結(jié)構(gòu)類似物無(wú)交叉反應(yīng);抗體親和力常數(shù)為3.06×10-9mol/l;抗獨(dú)特型抗體20%抑制濃度1.12μg/ml;抗獨(dú)特型抗體50%抑制濃度2.63μg/ml;抗獨(dú)特型抗體80%抑制濃度6.72μg/ml;線性范圍0.79~8.24μg/ml。 5建立抗獨(dú)特型抗體與T-2毒素標(biāo)準(zhǔn)品之間對(duì)應(yīng)關(guān)系曲線,得到二者之間濃度對(duì)數(shù)關(guān)系方程Y=2.0651914X+8.7597689 6制備出T-2毒

11、素的無(wú)毒ELISA定量檢測(cè)試劑盒,試劑盒技術(shù)參數(shù)如下:抗獨(dú)特型抗體替代毒素競(jìng)爭(zhēng)單克隆抗體標(biāo)準(zhǔn)曲線,回歸方程y=-0.7671085x-2.368525(R2=0.994),由T-2毒素和抗獨(dú)特型抗體濃度轉(zhuǎn)換關(guān)系方程得,對(duì)T-2毒素最低檢出限為0.5ng/ml(2.5μg/kg),線性范圍0.5~178.38ng/ml。50%的抑制濃度為27.16ng/ml。對(duì)小麥作4ng/ml,20ng/ml和100ng/ml3個(gè)加標(biāo)濃度(20、100

12、、500μg/kg),平均回收率分別為101.4%、95.2和83.17%;三個(gè)水平的變異系數(shù)分別為14.4%,7.9%和7.39%。經(jīng)ELISA測(cè)定其三個(gè)加標(biāo)水平實(shí)驗(yàn)室間變異系數(shù)分別是11.1%,3.9%和4.3%;實(shí)驗(yàn)室內(nèi)變異系數(shù)分別是12.1~15.0%,7.9~13.1%,7.7~10.0%;4℃保存較為穩(wěn)定,37℃可放置半年以上。 結(jié)論:1用T-2-GIgG免疫BALB/c小鼠,運(yùn)用細(xì)胞融合雜交瘤技術(shù),建立了穩(wěn)定分泌抗

13、T-2毒素單克隆抗體的雜交瘤細(xì)胞系。 2利用獲得的抗體,采用無(wú)花果蛋白酶酶切的方法以及FPLC法,建立了快速制備F(ab')2片斷的方法,并鑒定F(ab')2片斷和單抗具有同樣的免疫反應(yīng)性,同時(shí)F(ab')2片斷還具有良好的免疫原性,可作為免疫原,用于抗獨(dú)特型抗體的生產(chǎn)。 3利用獲得的抗獨(dú)特型抗體,開(kāi)始研制無(wú)毒ELISA檢測(cè)試劑盒,建立了檢測(cè)T-2毒素的間接ELISA法,目前本方法的最低檢出限為2.5μg/kg,小麥樣品

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