水產(chǎn)品中環(huán)丙沙星ELISA快速檢測試劑盒的初步研制.pdf

1、本文分別采用碳二亞胺法和氯甲酸乙丁酯法制備環(huán)丙沙星的牛血清白蛋白(BSA)與卵清白蛋白(OVA)載體的人工完全抗原CPFX-BSA和CPFX-OVA。人工完全抗原經(jīng)SDS-PAGE凝膠電泳初步鑒定后,考馬斯亮藍(lán)染色法測定蛋白質(zhì)分別為1.24 mg／mL和0.58 mg／mL,將偶聯(lián)抗原稀釋至一定濃度,紫外分光光度法測其波形,根據(jù)偶聯(lián)前后波形及吸收峰的變化鑒定偶聯(lián)物分子量大于載體蛋白,證實(shí)CPFX與BSA和OVA偶聯(lián)成功,根據(jù)游離半抗原、

2、載體蛋白和完全抗原偶聯(lián)物各自的紫外吸光度、摩爾吸光系數(shù)初步定量計(jì)算出偶聯(lián)結(jié)合比分別為7.2:1和6.4:1。質(zhì)譜法測定CPFX-BSA和CPFX-OVA分子量分別為6.895×104和4.586×104,推算偶聯(lián)比分別為5.6:1和4.2:1,進(jìn)一步證實(shí)了偶聯(lián)比和人工抗原制備成功。制備的完全抗原CPFX-BSA和CPFX-OVA可分別作為人工完全免疫抗原和人工完全包被抗原。
　　 以合成的完全抗原CPFX-BSA免疫Balb／c

3、小鼠,采用雜交瘤技術(shù)制備抗CPFX-BSA的單克隆抗體,獲得1株穩(wěn)定分泌針對CPFX藥物的單克隆抗體細(xì)胞株CPFX5G4,腹水效價(jià)達(dá)1.28×106；SDS-PAGE電泳分析CPFX5G4蛋白重鏈和輕鏈的分子量約為50 KD和25 KD；抗體亞型為IgG3；與部分喹諾酮類藥物交叉反應(yīng)率在8.42％～17.22％之間,與恩諾沙星的交叉反應(yīng)率為62.45％,與其他常見藥物不發(fā)生交叉反應(yīng)。在CPFX5G4的基礎(chǔ)上優(yōu)化CPFX檢測試劑盒的間接競

4、爭ELISA方法,建立ic-ELISA標(biāo)準(zhǔn)工作曲線,曲線方程為y=-0.4291x+1.4802,相關(guān)指數(shù)R2=0.9928,IC50值為192.44 ng／mL,最低檢測限為16.29 ng／mL,線性檢測范圍在15.625～1000 ng／mL之間。分別以鰻鱺血漿、肌肉為基質(zhì)進(jìn)行藥物添加回收試驗(yàn),經(jīng)檢測添加回收率在60.02％～110.05％之間,平均添加回收率分別為88.74％、78.00％,基本滿足ELISA免疫法測定獸藥殘留的