小反芻獸疫病毒抗體、抗原免疫學(xué)檢測(cè)方法和納米金核酸檢測(cè)方法的建立.pdf

1、小反芻獸疫是能感染家養(yǎng)及野生小反芻動(dòng)物的一種傳染性疾病。目前,小反芻獸疫呈現(xiàn)蔓延的趨勢(shì)。2007年我國(guó)西藏地區(qū)發(fā)生小反芻獸疫疫情,這是我國(guó)首次有該疾病發(fā)生的報(bào)道,因此建立靈敏、特異、快速的檢測(cè)方法對(duì)于早期發(fā)現(xiàn)小反芻獸疫非常重要。本研究旨在建立能快速且特異檢測(cè)小反芻獸疫抗體、抗原和核酸的分子生物學(xué)和免疫學(xué)方法。
　　 利用從奧地利引進(jìn)的PPRV N基因全長(zhǎng)質(zhì)粒,根據(jù)N蛋白序列的保守性分別設(shè)計(jì)5對(duì)引物進(jìn)行N蛋白的分段擴(kuò)增,然后將PC

2、R擴(kuò)增片段克隆至原核表達(dá)載體pET-32a(+)中,構(gòu)建了PPRVN亞單位蛋白的原核重組表達(dá)質(zhì)粒。將亞單位蛋白進(jìn)行純化,并通過Western blot和ELISA進(jìn)行鑒定。Western blot分析表明除第3亞單位蛋白以外,其余亞單位蛋白均具有反應(yīng)原性。ELISA鑒定結(jié)果表明,PPRV N蛋白的B細(xì)胞表位主要位于第5亞克隆區(qū)域,即N蛋白的第Ⅳ區(qū)域。
　　 選擇具有反應(yīng)原性且具有PPRV特異性的亞單位蛋白pET-PPRV-N5作

3、為包被抗原,建立間接ELISA方法用于檢測(cè)血清中PPRV抗體。對(duì)所建立的間接ELISA方法的相關(guān)條件進(jìn)行了優(yōu)化,優(yōu)化后的間接ELISA檢測(cè)方法具有較高的特異性和靈敏性,與標(biāo)準(zhǔn)競(jìng)爭(zhēng)ELISA的符合率高達(dá)98.4％。
　　 從PPRV山羊高免血清純化得到山羊抗PPRV的多克隆抗體(PAbs),采用檸檬酸鈉還原法制備膠體金溶液,并將PAbs標(biāo)記至膠體金顆粒上制備金標(biāo)墊。將純化后的重組pET-PPRV-N蛋白及anti-goat IgG

4、分別包被至硝酸纖維素膜的檢測(cè)線(T線)及質(zhì)控線(C線),將金標(biāo)墊、NC膜等組裝成膠體金試紙條。所制備的膠體金試紙條可以特異性的檢測(cè)PPRV抗原,檢測(cè)極限達(dá)到10 ng,該方法具有良好的特異性,操作簡(jiǎn)便,可廣泛應(yīng)用丁基層檢測(cè)。
　　 針對(duì)PPRV N基因設(shè)計(jì)一對(duì)探針,分別在5’端和3’端修飾上巰基和生物素。將巰基化的探針標(biāo)記至檸檬酸鈉還原法制備的納米金顆粒上,制備納米金核酸探針,將納米金核酸探針與靶序列及生物素標(biāo)記的探針進(jìn)行雜交,