免疫學(xué)檢測方法_第1頁
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文檔簡介

1、檢測技術(shù)種類,一、免疫學(xué)檢測 免疫凝集試驗(yàn) 免疫沉淀試驗(yàn) 酶聯(lián)免疫試驗(yàn) 熒光免疫技術(shù) 免疫電鏡技術(shù) 免疫印跡試驗(yàn),細(xì)菌凝集反應(yīng)被廣泛應(yīng)用于細(xì)菌學(xué)的診斷。在凝集反應(yīng)中,將參與反應(yīng)的抗原稱為凝集原,抗體稱為凝集素。凝集法測定哈維氏弧菌抗體的效價(jià),1.稀釋抗體,2.玻片凝集法,用1ml移液槍取6號離心管中的溶液一滴滴在載玻片的一端,另一端加一滴磷酸鹽緩沖液,然后分別加一滴準(zhǔn)備好的X菌液。 牙簽混勻,至于顯微鏡下觀察

2、,看是否有凝集塊的形成。 后取5、4……1號管的溶液逐個重復(fù)1、2步驟。 取有凝集塊變?yōu)闊o凝集塊時,那個有凝集反應(yīng)的試管作為抗體的效價(jià)。,沉淀凝集反應(yīng),雙向免疫擴(kuò)散沉淀線示意圖,瓊擴(kuò)反應(yīng),中和實(shí)驗(yàn),熒光免疫技術(shù),熒光免疫技術(shù)又稱熒光抗體技術(shù)。它將免疫化學(xué)和血清學(xué)的高度特異性和敏感性與顯微技術(shù)的高度精確性相結(jié)合,為免疫學(xué)、臨床組織化學(xué)及實(shí)驗(yàn)室診斷提供了一項(xiàng)其它方法尚不能取代的、并有其獨(dú)特風(fēng)格的技術(shù)。目前,該技術(shù)已廣泛應(yīng)用于細(xì)菌、病毒、

3、原蟲以及真菌等的鑒定和相應(yīng)病的診斷,血清抗體的檢查,病理組織學(xué)抗原、抗體和補(bǔ)體的鑒定及定位,免疫復(fù)合物病理的研究,細(xì)菌、病毒與細(xì)胞之間抗原關(guān)系的研究等方面。其主要優(yōu)點(diǎn)在于:特異性強(qiáng),速度快,敏感性高;其缺點(diǎn)在于:非特異性染色問題尚未解決,結(jié)果判定的客觀性不足,技術(shù)程序也比較復(fù)雜。,1、原理,熒光免疫技術(shù)是一種以熒光物質(zhì)作為標(biāo)記物的免疫分析技術(shù),熒光物質(zhì)的分子在特定條件下吸收激發(fā)光的能量后,分子呈激發(fā)態(tài)而極不穩(wěn)定,其迅速回到基態(tài)時,以電磁

4、輻射形式釋放出所有的光能,發(fā)射出波長較照射光長的熒光。熒光免疫技術(shù)可分為熒光免疫組織化學(xué)技術(shù)和熒光測定技術(shù)。熒光抗體技術(shù)屬于前者,它是利用某些熒光素通過化學(xué)方法與特異性抗體結(jié)合,形成的免疫復(fù)合物在一定波長光的激發(fā)下可產(chǎn)生熒光,因此借助熒光顯微鏡檢測或定位被檢抗原。其又可分為直接熒光抗體法、間接熒光抗體法和補(bǔ)體熒光抗體法。,熒光色素,異硫氰酸熒光素(FITC)四乙基羅丹明(RB200)四甲基異硫氰酸羅丹明(TMRITC),1、熒光抗體

5、染色方法 直接法 間接法2、熒光抗體技術(shù)的應(yīng)用 在細(xì)菌學(xué)診斷中的應(yīng)用 在病毒感染診斷中的應(yīng)用 其它方面的應(yīng)用,間接熒光抗體法(IFAT)操作步驟如下:(1)單層血細(xì)胞滴片,室溫晾干,放入丙酮中固定10min。室溫晾干。(2)以小白鼠抗血清(或雜交瘤細(xì)胞上清液)為第一抗體,加在血細(xì)胞抗原上。37℃濕盒中孵育45min。(3)0.01M PBS洗三次,

6、每次5min。(4)加第二抗體IgG-FITC ,37℃濕盒中孵育45min。(5)0.01M PBS洗三次,每次5min。(6)甘油封片,熒光鏡下觀察,拍照。,間接免疫熒光法檢測對蝦白斑癥病毒病,間接免疫熒光法檢測淋巴囊腫病毒,直接ELISA,間接ELISA,間接酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)操作步驟如下:(1)分別以不同單抗為第一抗體,加在血細(xì)胞抗原上。37℃濕盒中孵育60min。(2)0.01M PBS洗三次,每次5min。(3)

7、加AP-IgG 為第二抗體,37℃濕盒中孵育45min。(4)0.01M PBS洗三次,每次5min。(5)加NBT/BCIP底物緩沖液發(fā)色10min,(6)出現(xiàn)顏色加終止液終止反應(yīng)。 (7)用酶標(biāo)分析儀在405nm,處測定各孔的吸光度,計(jì)算P/N(樣品光吸收值與陰性對照的值),判定ELISA反應(yīng)結(jié)果。大于2.1時可判斷為陽性。以最大顯色至陽性的顯色孔50%反應(yīng)孔的抗體稀釋倍數(shù)為抗體效價(jià)。,圖 DOT BLOT方法篩選結(jié)果圖。,

8、免疫組織化學(xué)方法定扇貝血細(xì)胞分布,細(xì)胞免疫化學(xué)法檢測病毒感染,四、Western blot,是蛋白水平檢測,研究基因表達(dá)與功能的一種方法。 原理及步驟 樣品 聚丙烯酰胺凝膠電泳,分離蛋白 (SDS-PAGE )

9、 轉(zhuǎn)移(印跡)于硝酸纖維素膜 加抗體檢測某種特異性蛋白質(zhì),,,,West Blot,,圖:淋巴囊腫病毒與抗血清的Western blotting結(jié)果,免疫電鏡技術(shù),免疫電鏡技術(shù)(immune electron microscopic technique)是一種將免疫學(xué)技術(shù)與電子顯微鏡技術(shù)相結(jié)合的血清學(xué)方法,能使抗原在分子水平上進(jìn)

10、行定位。它實(shí)際上是將細(xì)胞水平的熒光抗體技術(shù)的基本原理應(yīng)用于分子水平上。這一技術(shù)的發(fā)明使抗原和抗體的定位研究達(dá)到了亞細(xì)胞或分子水平。主要有以下幾種技術(shù)。鐵蛋白抗體法酶標(biāo)記抗體法重金屬標(biāo)記抗體法,圖 膠體金標(biāo)記免疫電鏡結(jié)果[(A) (D) bar = 200 nm; (B) (C) bar = 100 nm],膠體金免疫技術(shù),膠體金是氯金酸在還原劑如白磷、抗壞血酸等作用下的水溶液,具有高電子密度,并能與多種大分子發(fā)生物理吸附,因此,不

11、但所有的大分子物質(zhì)都可被金標(biāo)記,而且標(biāo)記后大分子物質(zhì)活性不發(fā)生改變。當(dāng)抗原和金標(biāo)抗體反應(yīng)時,肉眼可見紅色或粉紅色斑條(點(diǎn)),在顯微鏡下觀察,抗原抗體結(jié)合處為黑褐色的顆粒。,斑點(diǎn)免疫金滲濾法(DIGFA)的應(yīng)用 與研究進(jìn)展 是20世紀(jì)八十年代發(fā)展起來的一種免疫學(xué)檢 測方法,具有簡便、快速、準(zhǔn)確等優(yōu)點(diǎn)。目前在 醫(yī)學(xué)檢驗(yàn)中主要應(yīng)用于檢測 HBsAg、HCG 和HIV等。,斑點(diǎn)免疫金滲濾法原理

12、: NCM為固相載體-----通過滲濾----抗原與抗體在膜上快速反應(yīng)-----標(biāo)記的膠體金堆積顯色。,臨床應(yīng)用: 間接法測抗體: NCM 抗原----樣品抗體----金標(biāo)抗抗體顯色 夾心法測抗原: NCM多抗----樣品抗原----金標(biāo)單抗顯色。,直接法檢測抗原 NCM病毒---金標(biāo)單抗顯色

13、DIGFA步驟簡化、時間縮短。,DIGFA檢測操作程序2µl檢測樣品-----NCM----直徑2mm點(diǎn)-----晾干; 100µl封閉液,滲入; 100µl的金標(biāo)抗體,滲入;100µl 的0.01M PBS-T(含0.05%Tween-20),滲入;

14、 檢測結(jié)果:紅色斑點(diǎn)的為陽性,無紅色斑點(diǎn)的為陰性。 陽性代表檢測樣品中有病毒,陰性則無。,,,,,DIGFA檢測結(jié)果, 紅色斑點(diǎn)的為病毒陽性,無紅色斑點(diǎn)的為病毒陰性。The result of DIGFA, red dot shows there is WSSV, otherwise, there is no WSSV.,免疫金標(biāo)層析法的應(yīng)用與研究進(jìn)展,免疫金層析法快速診斷試紙

15、條是20世紀(jì)90年代以來在單克隆抗體技術(shù)、膠體金免疫層析技術(shù)和新材料技術(shù)基礎(chǔ)上發(fā)展起來的一項(xiàng)新型體外診斷技術(shù) 醫(yī)學(xué):乙肝表面抗原、心肌肌鈣蛋白T 、 HCG 獸醫(yī):豬瘟抗體 食品:克倫特羅(瘦肉精)、氯霉素 其他:飼料中的磺胺類藥物殘留物、轉(zhuǎn)基因產(chǎn)品,檢測試紙的原理是:采用夾心免疫層析原理,即由金標(biāo)單抗同檢測樣品液中的抗原反應(yīng),形成由金標(biāo)單抗-抗原復(fù)合物,當(dāng)該復(fù)合物層析至硝酸纖

16、維素膜上預(yù)先包被在檢測線上的另一種單抗處時,此處的抗體會識別該復(fù)合物中抗原,反應(yīng)的結(jié)果便形成了金標(biāo)單抗+抗原+包被單抗的夾心結(jié)構(gòu),最終是金標(biāo)單抗上的膠體金顆粒在此固定并累積出現(xiàn)肉眼可見的紅色線,未反應(yīng)的金標(biāo)單抗則仍繼續(xù)層析前行,當(dāng)?shù)竭_(dá)點(diǎn)預(yù)先包被在質(zhì)控線羊抗鼠抗體處時,金標(biāo)單抗被其結(jié)合住,從而在此處也出現(xiàn)由膠體金顆粒固定并累積而顯現(xiàn)出肉眼可見的紅色線,結(jié)果是:檢測線顯示紅色表示樣品陽性;檢測線不顯示紅色,表示樣品陰性。質(zhì)控線顯示紅色,表示

17、試紙有效;質(zhì)控線處不顯示紅色,說明試紙失效,即或是金標(biāo)單抗、或是羊抗鼠抗體失活,檢測結(jié)果無效。,該試紙條構(gòu)成:載體板7;在該載體板7的兩端部,分別設(shè)有加樣端4吸水層和手持端1吸水層;在該載體板7中部段設(shè)有硝酸纖維膜的檢測層2,在該檢測層2與加樣端4吸水層交界處,設(shè)有載有金標(biāo)單抗E的玻璃纖維層塊3,該層塊3一端部分設(shè)置在加樣端4吸水層之下,其另一端部分設(shè)置在檢測層2之上;在與該層塊3延續(xù)的檢測層2上設(shè)有檢測線6和質(zhì)控線5,該檢測線6和質(zhì)控

18、線5處分別包被有抗病毒單抗和羊抗鼠IgG。,用吖啶酯直接標(biāo)記抗體(抗原),與待測標(biāo)本中相應(yīng)的抗原(抗體)發(fā)生免疫反應(yīng)后,形成固相包被抗體-待測抗原-吖啶酯標(biāo)記抗體復(fù)合物,這時只需加入氧化劑(H2O2)和NaOH使成堿性環(huán)境,吖啶酯在不需要催化劑的情況下分解、發(fā)光 。 由集光器和光電倍增管接收、記錄單位時間內(nèi)所產(chǎn)生的光子能,這部分光的積分與待測抗原的量成正比,可從標(biāo)準(zhǔn)曲線上計(jì)算出待測抗原的含量。,直接化學(xué)發(fā)光免疫分析,發(fā)光,Y,Y

19、,,Y,,,磁微粒,,被測抗原,+,抗體,+,,帶丫啶酯標(biāo)記物抗體,,,,,,沖洗后,,,--- 夾心法,(1)加入H2O2(pH<10),,,,(2)加入堿(pH>10),,直接化學(xué)發(fā)光的機(jī)理,,,,磁微粒模式圖,,,,,,,Y,,Y,,Y,Y,,Y,Y,,Y,Y,Y,Y,Y,,,,,Y,,特點(diǎn)已結(jié)合的抗原和抗體與未結(jié)合部分的易分離,磁微粒技術(shù),五、聚合酶鏈反應(yīng)(polymerase chain reaction

20、,PCR),PCR是模擬體內(nèi)DNA復(fù)制條件,應(yīng)用DNA聚合酶反應(yīng),特異性擴(kuò)增某一DNA片段的技術(shù)。體外程序化的DNA合成技術(shù)。,Kary B. Mullis,PCR,,ACGTAGTAGCATAGCAATGTACATCATCAGATAGACGATTGACAGTGATCTCGACGATGCATC,TTGCATCATCGTATCGTTACATGTAGTAGTCTATCTGCTAACTGTCACTAGAGCTGCTACGTAA,Step3 :

21、 Extension 延伸,72°C,CGTAGTAGCA,GCTGCTACGTAG,TAGCAATGTACATCATCAGATAGACGATTGACAGTGATCTCGACGATGCATC,GCATCATCGTATCGTTACATGTAGTAGTCTATCTGCTAACTGTCACTAGA,原 理:,1) 合成待擴(kuò)增區(qū)域兩端已知序列,與模板DNA互補(bǔ)的寡核苷酸特異性引物,引物的序列決定擴(kuò)增片段的長度;2) 反應(yīng)

22、體系:DNA模板,dNTP,Taq DNA聚合酶,buffer3) 反應(yīng)程序: 變性 ( 94~95oC) 復(fù)性 延伸 ( 37~55 oC) ( 70~72 oC ) 7

23、2 oC延伸10min 30-35cycles DNA擴(kuò)增100萬倍,,,,,PCR擴(kuò)增,,PCR特點(diǎn)及應(yīng)用:,優(yōu)點(diǎn):(1)特異性強(qiáng)、靈敏度高、穩(wěn)定可靠、快速; (2)微量的模板DNA即可擴(kuò)增大量產(chǎn)物。應(yīng)用:(1)基因組DNA分析; (2)遺傳物質(zhì)的鑒定; (3)遺傳病的診斷。缺點(diǎn):(1)需靶DNA序列的信息;

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