免疫學(xué)檢測(cè)中的曲線擬合

1、免疫測(cè)定中的數(shù)據(jù)處理與曲線擬合,免疫測(cè)定中的數(shù)據(jù)處理數(shù)據(jù)處理與科學(xué)作圖,,免疫測(cè)定中的數(shù)據(jù)處理與曲線擬合,免疫測(cè)定的數(shù)據(jù)處理及結(jié)果報(bào)告,臨床免疫檢測(cè)技術(shù)：RIA和EIA等；數(shù)據(jù)處理的意義和目標(biāo)：只有在測(cè)定結(jié)果以一種有意義的方式報(bào)告時(shí)，測(cè)定結(jié)果才有用；免疫測(cè)定結(jié)果的客觀評(píng)價(jià)，對(duì)改善免疫測(cè)定的重復(fù)性以及免疫測(cè)定的標(biāo)準(zhǔn)化都有重要意義。數(shù)據(jù)處理報(bào)告的要求：通俗易懂；定性結(jié)果明確，定量范圍明確；處理后得到的數(shù)據(jù)要具有可重復(fù)性；

2、試驗(yàn)的評(píng)價(jià)不能建立在假定的正態(tài)分布上；結(jié)果具有用于進(jìn)一步分析處理（如流行病學(xué)）的充分性。免疫測(cè)定以其測(cè)定結(jié)果的表達(dá)方式：定性，定量?jī)深悺?定性測(cè)定--- “有” 或“無”,判定結(jié)果：陰性，陽性。判定依據(jù)：cut-off值，S/N or P/N比值。判斷依據(jù)確立原則：盡可能避免假陽性和假陰性結(jié)果的出現(xiàn)。應(yīng)用：傳染性病原體的血清標(biāo)志物檢測(cè)。,定性測(cè)定數(shù)據(jù)處理 --cut-off值的確定,相關(guān)概念： ELISA測(cè)定的“灰區(qū)”---

3、 陽性判斷值的確定就是要使以其得到的測(cè)定結(jié)果的假陽性和假陰性的發(fā)生率最低，處于陽性判斷值定值域中的測(cè)定結(jié)果可歸為可疑，亦即ELISA測(cè)定的“灰區(qū)”。,定性測(cè)定數(shù)據(jù)處理 --cut-off值的確定,Cut-off 值設(shè)定的一般方法：標(biāo)準(zhǔn)差比率 standard deviation ratio, SDR測(cè)定標(biāo)本對(duì)陰性比值（P/N or S/N） test to negative ratio, TNR以陰性對(duì)照均值+2或3SD作為

4、cut-off值綜合陰性對(duì)照均值+2或3SD及陽性對(duì)照-2或3SD建立cut-off值綜合陰性對(duì)照均值+2或3SD及陽性對(duì)照-2或3SD和轉(zhuǎn)化血清結(jié)果建立cutoff值百分位數(shù)法相對(duì)單位（relative units, EIU): 標(biāo)本EIU=雙質(zhì)控（double control，2C）：0.18X（陰性質(zhì)控物中值+陽性質(zhì)控物中值）使用ROC曲線設(shè)定cut-off值,使用ROC曲線設(shè)定cut-off 值：,ROC曲線：橫坐標(biāo)

5、為假陽性率FPR=[假陽性數(shù)/（假陽性+真陰性）] 縱坐標(biāo)為真陽性率TPR=[真陽性數(shù)/（真陽性+假陰性）],根據(jù)這種關(guān)系確定區(qū)分正常與異常的分界點(diǎn)究竟在何處最合適，也就是說此時(shí)的假陽性和假陰性率最低或比例最適當(dāng)或最為符合使用目的，該分界點(diǎn)即可作為ELISA cut-off值。,ROC曲線的含義：,陽性人群的測(cè)定值與陰性人群的測(cè)定值重疊程度越小，即測(cè)定的識(shí)別能力越高，ROC曲線越偏向上，曲線下面積越大。,定量測(cè)定

6、---測(cè)定待測(cè)物的含量,判定結(jié)果：濃度（U/L，μg/L）。判斷依據(jù)：測(cè)定未知標(biāo)本的同時(shí)，以系列濃度標(biāo)準(zhǔn)品測(cè)得的劑量反應(yīng)曲線（即標(biāo)準(zhǔn)曲線）以此推算未知標(biāo)本的濃度。劑量反應(yīng)曲線：一般均為非線性的，不同的數(shù)學(xué)模式可以用來改善上述劑量反應(yīng)曲線繪制的精密度，從而以較少的數(shù)據(jù)和計(jì)算獲得較為準(zhǔn)確的結(jié)果。應(yīng)用：非傳染性血清學(xué)指標(biāo)。,免疫測(cè)定中的劑量反應(yīng)曲線,（相對(duì)于定量生化）：非線性→測(cè)定反應(yīng)和待測(cè)物濃度之間的關(guān)系不一定是一條簡(jiǎn)單的直線；可

7、能存在與系列標(biāo)準(zhǔn)品的測(cè)定數(shù)據(jù)擬合的多條曲線→可能因曲線的選擇而造成偏差；具有相對(duì)大的且方差不齊的測(cè)定誤差，且在標(biāo)準(zhǔn)曲線的不同位置、在不同批的測(cè)定之間這種誤差亦不同。,單純線性回歸往往不能反應(yīng)真實(shí)情況,Figure 1 Falsely low and falsely elevated assay values resulting from drawing a straight line for the calibration curve

8、.,,數(shù)據(jù)處理與科學(xué)作圖,問題：給定一批離散的數(shù)據(jù)點(diǎn)，需確定滿足特定要求的曲線或 曲面,從而獲取整體的規(guī)律。目標(biāo)：用一個(gè)解析函數(shù)描述一組（二維）數(shù)據(jù)(通常是測(cè)量值)。方法：插值法 -- 數(shù)據(jù)假定是正確的，要求以某種方法描述數(shù)據(jù)點(diǎn)之間所發(fā)生的情況；曲線擬合或回歸-- 設(shè)法找出某條光滑曲線，使它最佳 地?cái)M合數(shù)據(jù)，但不必要經(jīng)過任何數(shù)據(jù)點(diǎn)。曲線及相應(yīng)數(shù)學(xué)公式表明數(shù)據(jù)對(duì)（如標(biāo)準(zhǔn)品濃度與測(cè)定信號(hào)）之間

9、的比例關(guān)系。,擬合 與 插值 的 比 較,,數(shù)據(jù)擬合：又稱曲線擬合或曲面擬合，不要求曲線（面）通過所有數(shù)據(jù)點(diǎn)，而是要求它反映對(duì)象整體的變化趨勢(shì)時(shí)應(yīng)用。,插值：要求所求曲線（面）通過所給所有數(shù)據(jù)點(diǎn)時(shí)應(yīng)用；,從幾何意義上看，擬合是給定了空間中的一些點(diǎn)，找到一個(gè)已知形式的連續(xù)曲面來最大限度地逼近這些點(diǎn)；而插值是找到一個(gè)(或幾個(gè)分片光滑的)連續(xù)曲面來穿過這些點(diǎn)。,線性內(nèi)插與2階曲線擬合,,插值法 interpolative methods,假設(shè)

10、：反應(yīng)變量的已知絕對(duì)精密；曲線構(gòu)建：以觀察到的數(shù)據(jù)構(gòu)建曲線；方法：點(diǎn)對(duì)點(diǎn)（線性插值）樣條插值 spline function,點(diǎn)對(duì)點(diǎn)（線性插值）,假設(shè)：中間值落在數(shù)據(jù)點(diǎn)之間的直線上；當(dāng)數(shù)據(jù)點(diǎn)個(gè)數(shù)增加和它們之間距離減小時(shí)，線性插值就更精確；適用范圍：線性范圍大或數(shù)據(jù)點(diǎn)多且相互緊密相連；處理：為使數(shù)據(jù)更具有線性關(guān)系，可對(duì)數(shù)據(jù)進(jìn)行某些方式的轉(zhuǎn)換（如對(duì)數(shù)轉(zhuǎn)換），然后在轉(zhuǎn)換數(shù)據(jù)上進(jìn)行線性插值。,將臨近的校準(zhǔn)點(diǎn)以點(diǎn)對(duì)點(diǎn)的方式用一

11、條直線連起來。,線性插值在免疫檢測(cè)中的應(yīng)用：,采用某些更光滑的曲線來擬合數(shù)據(jù)點(diǎn)；最常用的方法是3階多項(xiàng)式，對(duì)相繼數(shù)據(jù)點(diǎn)之間的各段建模，這種類型的插值被稱為3次樣條或簡(jiǎn)稱為樣條；處理：為將每一個(gè)短曲線相互之間平滑地連起來，需對(duì)其進(jìn)行修飾（smoothing），這需要反復(fù)重新計(jì)算所有的曲線直至每一片段與其數(shù)據(jù)點(diǎn)的擬合間的連接可以接受。結(jié)點(diǎn)（knots，校準(zhǔn)物的濃度值）越多意味著數(shù)據(jù)處理工作量的增大；適用范圍：當(dāng)希望曲線密切遵循單個(gè)的

12、校準(zhǔn)物數(shù)據(jù)點(diǎn)時(shí)，或數(shù)據(jù)非常精密并有多個(gè)校準(zhǔn)物時(shí)可選用，否則應(yīng)避免使用；,樣條插值 spline function,將臨近的校準(zhǔn)點(diǎn)以一條曲線連起來，對(duì)整個(gè)標(biāo)準(zhǔn)曲線上各點(diǎn)間的短片段進(jìn)行數(shù)學(xué)計(jì)算得到一條曲線，所獲得的合成數(shù)學(xué)函數(shù)稱為樣條函數(shù)。,線性插值 樣條插值,兩種插值結(jié)果完全不同，因?yàn)椴逯凳且粋€(gè)估計(jì)或猜測(cè)的過程，其意義在于，應(yīng)用不同的估計(jì)規(guī)則導(dǎo)致不同的結(jié)果。,樣條插值與線性插值：,,,特點(diǎn)：完全擬合試驗(yàn)數(shù)據(jù)；

13、 每一片段基本上與其他部分無關(guān)；問題：對(duì)數(shù)據(jù)點(diǎn)的精密度和準(zhǔn)確性依賴大； 每一個(gè)片段都應(yīng)有一個(gè)質(zhì)控樣本，而這往往是做不到的； 無法完全解決hooks出現(xiàn)引起的不準(zhǔn)確； 有時(shí)較其他“復(fù)雜”模式更費(fèi)時(shí)。影響因素：確定某部分曲線的兩個(gè)校準(zhǔn)點(diǎn)的準(zhǔn)確度和精密度。,插值法interpolative methods及其應(yīng)用,曲線構(gòu)建：以符合數(shù)據(jù)點(diǎn)規(guī)律的經(jīng)驗(yàn)?zāi)Ｊ綐?gòu)建曲線；目標(biāo)：反映對(duì)象整體的變化趨勢(shì)；達(dá)到最佳擬合的方法

14、——線性最小二乘準(zhǔn)則；擬合模式：雙曲線模式 hyperbolic model多項(xiàng)式模式 polynomial modelLog-Logit轉(zhuǎn)換Logistic公式（兩參數(shù)，四參數(shù)）,曲線擬合與回歸 curve fitting,曲線擬合問題的提法：已知一組（二維）數(shù)據(jù)，即平面上 n個(gè)點(diǎn)（xi,yi) i=1,…n, 尋求一個(gè)函數(shù)（曲線）y=f(x), 使 f(x) 在某種準(zhǔn)則下與所有數(shù)據(jù)點(diǎn)最為接近，即曲線擬合得最好。,1. 通

15、過機(jī)理分析建立數(shù)學(xué)模型來確定 f(x)；2. 將數(shù)據(jù) (xi,yi) i=1, …n 作圖，通過直觀判斷確定 f(x)：,擬合函數(shù)的選擇：,2階曲線擬合與10階曲線擬合,n=1作為階次，得到最簡(jiǎn)單的線性近似。通常稱為線性回歸；n=2作為階次，得到一個(gè)2階多項(xiàng)式；高階多項(xiàng)式給出很差的數(shù)值特性，不應(yīng)選擇比所需的階次高的多項(xiàng)式。,擬合曲線的階次：,,,,,,,,,,,,,,雙曲線模式 hyperbolic curve：曲線形狀：雙

16、曲線；假定數(shù)據(jù)擬合下式：y=a+b(1/x) 或(1/y)=p+q(x)。,多項(xiàng)式模式：曲線形狀：拋物線；假定校準(zhǔn)曲線擬合下述曲線形式；y=a+bx+cx2+dx3+……+pxn。,Log-Logit轉(zhuǎn)換：曲線形狀：具有單點(diǎn)屈曲的連續(xù)性S形函數(shù)；假定校準(zhǔn)曲線擬合下述曲線形式：logit（y）=a+b*ln（x），其中l(wèi)ogit（z）=ln[z/（1-z）]。,Logistic公式（兩參數(shù)，四參數(shù)）：曲線形狀：

17、具有單點(diǎn)屈曲的連續(xù)性S形函數(shù)；假定校準(zhǔn)曲線擬合下述曲線形式：logistic公式：Y= +dx以對(duì)數(shù)表示時(shí)曲線呈線性。,擬合模式：,1）將校準(zhǔn)物濃度的倒數(shù)對(duì)測(cè)定反應(yīng)作圖或以B0/B對(duì)校 準(zhǔn)物濃度作圖；2）最小平方線性回歸。,雙曲線擬合 hyperbolic curve：,y=a+b(1/x) 或(1/y)=p+q(x),問題：標(biāo)準(zhǔn)曲線的端值得不到好的擬合（特別是低濃度端）；測(cè)定誤差

18、為倒數(shù)，與實(shí)際誤差規(guī)律相反；不具有S形，限制了應(yīng)用。雙曲線擬合模式：競(jìng)爭(zhēng)性免疫測(cè)定數(shù)據(jù)（在限定范圍內(nèi)的值）能擬合很好的平滑曲線。,雙曲線模式 hyperbolic curve應(yīng)用,1）將測(cè)定反應(yīng)對(duì)校準(zhǔn)物濃度作圖；2）對(duì)多項(xiàng)式進(jìn)行最小平方回歸。,多項(xiàng)式擬合：,適用范圍：一個(gè)三次多項(xiàng)式可被快速和成功地用于競(jìng)爭(zhēng)免疫測(cè)定數(shù)據(jù)擬合；非競(jìng)爭(zhēng)性免疫測(cè)定：有部分校準(zhǔn)曲線為直線，可能擬合不好；x的次方為非整數(shù)時(shí)能夠再現(xiàn)校準(zhǔn)曲線的實(shí)際線性部

19、分，但在零濃度附近和高濃度時(shí)不準(zhǔn)確，需要截尾。問題：一個(gè)給定反應(yīng)值可能對(duì)應(yīng)兩個(gè)結(jié)果，因此需對(duì)校正曲線進(jìn)行截尾。,多項(xiàng)式模式應(yīng)用,1）將logit （B/B0）對(duì)校準(zhǔn)物濃度的對(duì)數(shù)作圖；2）對(duì)轉(zhuǎn)換后的曲線進(jìn)行最小平方回歸可得到良好的直線。,Log-Logit 轉(zhuǎn)換曲線：,logit（y）=a+b*ln（x）,logit（y）=a+b*ln（x）,適用范圍：競(jìng)爭(zhēng)免疫測(cè)定數(shù)據(jù)擬合。問題：不能包含零校準(zhǔn)物點(diǎn)；不能包含放免中的非特

20、異結(jié)合數(shù)據(jù)。,Log-Logit轉(zhuǎn)換應(yīng)用：,1）將測(cè)定反應(yīng)對(duì)校準(zhǔn)物濃度的對(duì)數(shù)作圖；2）對(duì)轉(zhuǎn)換后的曲線進(jìn)行最小平方回歸。,Logistic公式（兩參數(shù)，四參數(shù)） ：,Y=（a-d）/[1+（X/C）b]+d兩參數(shù)：a=y0，d=yx y=（y0-yx）/[1+（X/C）b]+yx Y=log(y0-y)/(y-yx)=logit(y), X=log(x), A=-b, B=-blog(c)

21、 Logit(y)=Alog(x)+B四參數(shù)：不依賴于y0和yx的測(cè)定，更好地?cái)M合原始數(shù)據(jù)。,優(yōu)點(diǎn)：不會(huì)出現(xiàn)鉤狀（hooks）；問題：與直線公式相比logistic公式在代數(shù)學(xué)上是一個(gè)相當(dāng)復(fù)雜的公式，因此要找出“最佳擬合”相對(duì)較難；參數(shù)：a，b，c，d四參數(shù)，或帶入a&d值，則為b，c兩參數(shù)。,,Logistic公式（兩參數(shù)，四參數(shù)）應(yīng)用,例：在fPSA免疫分析中，四參數(shù)logistic擬合和四次多項(xiàng)式擬合

22、最接近真實(shí)值。,Figure 2 Effect of curve-fitting program applied on the degree (extent) of deviation of fPSA values from expected mean values of fPSA (represented by the dotted horizontal line).,劑量反應(yīng)曲線：通常為S形或雙曲線。目標(biāo)：曲線線性化，獲得數(shù)學(xué)模

23、式。方法：轉(zhuǎn)換一個(gè)或兩個(gè)變量（對(duì)數(shù)或倒數(shù)）；多項(xiàng)或其他方式的曲線線性回歸或比例轉(zhuǎn)換(logit)。最低要求：應(yīng)用時(shí)經(jīng)濟(jì)省時(shí)；一個(gè)反應(yīng)變量只對(duì)應(yīng)一個(gè)劑量結(jié)果（無hooks出現(xiàn)）。,總結(jié)：曲線擬合及其應(yīng)用,質(zhì)量作用定律模式和Scatchard作圖,曲線構(gòu)建：從化學(xué)原理（抗原抗體之間的反應(yīng)符合質(zhì)量作用定律）計(jì)算校準(zhǔn)曲線。原理：Ag+Ab?AbAg ， Ka= ， =Ka（n-[AbAg

24、]）n為反應(yīng)孔中抗體的最大結(jié)合能力，以mol/g抗體表示，Ka是平衡常數(shù)。Scatchard plot 繪制方法：以[AbAg]/[Ag]比值對(duì)[AbAg]作圖可得到一條直線；計(jì)算機(jī)軟件作圖。,特點(diǎn)：以化學(xué)理論為基礎(chǔ)，給出了免疫測(cè)定的化學(xué)本質(zhì)，比其他經(jīng)驗(yàn)?zāi)Ｊ礁煽俊栴}：在實(shí)際反應(yīng)中往往只在一定濃度范圍內(nèi)呈線性，受到以下條件限制— 1）抗原抗體均一（標(biāo)記物與非標(biāo)記物）和單價(jià)（多抗）； 2）抗原抗體反應(yīng)

25、必須達(dá)到平衡（非一步反應(yīng)）； 3）抗原抗體按照一級(jí)質(zhì)量作用定律反應(yīng)，無改變抗體或抗原反應(yīng)性的作用，如協(xié)同作用或變構(gòu)作用； 4）結(jié)合和游離物濃度必須為真正的測(cè)定值。使用范圍： 非競(jìng)爭(zhēng)免疫測(cè)定中雙抗夾心測(cè)定不能用。,Scatchard作圖及其應(yīng)用,相關(guān)應(yīng)用軟件,Thermo labsystems酶標(biāo)儀：可進(jìn)行的曲線擬合類型包括LINEAR REGRESSION， POINT TO POINT， QUAD. P

26、OLYNOMIAL， CUBIC POLYNOMIAL， CUBIC SPLINE， QUARTIC POLYNOMIAL， 4 PARAM. LOGISTIC，從中選出最佳擬合（“best fit”）。Program：RIA AID, ELISA AID (Robert Maciel Associates, Inc. Arlington, MA) 通用的處理程序，可進(jìn)行l(wèi)og-logit(加權(quán)、非加權(quán)）、四參數(shù)logistic擬合

27、、多項(xiàng)式擬合、點(diǎn)對(duì)點(diǎn)擬合等，可用于RIA和EIA。CurveExpert 1.3：linear regression models, nonlinear regression models, interpolation, or splines. Over 30 models。,摘自生物軟件網(wǎng) www.bio-soft.net,有關(guān)概念,準(zhǔn)確度accuracy—實(shí)驗(yàn)測(cè)得的分析物濃度與其真值之間符合程度。標(biāo)準(zhǔn)差standard dev

28、iation, SD —一組數(shù)據(jù)的離散度。變異系數(shù)coefficient of variation, CV —標(biāo)準(zhǔn)差以其均數(shù)的百分比來表示。重復(fù)性reproducibility —通過重復(fù)測(cè)定的SD或算術(shù)平均值的區(qū)間值來考察。測(cè)定下限detectability —超過零劑量精密度的最低抗原濃度。敏感性sensitivity —實(shí)驗(yàn)的測(cè)定反應(yīng)對(duì)待側(cè)物質(zhì)濃度變化的改變，即dR/dC。,夾心ELISA校準(zhǔn)曲線,優(yōu)化：為得到更大的線性

29、范圍，可提高包被抗體和檢測(cè)抗體的用量；標(biāo)準(zhǔn)曲線的不同位置精確度不同，這影響到標(biāo)準(zhǔn)曲線上數(shù)據(jù)點(diǎn)的疏密分布，并需要相應(yīng)的質(zhì)控品；不同批標(biāo)準(zhǔn)曲線之間亦有誤差，因此每批實(shí)驗(yàn)都應(yīng)重新坐標(biāo)準(zhǔn)確性。,Referrence,李金明，臨床酶免疫測(cè)定技術(shù). 人民軍醫(yī)出版社，2005.James T. Wu, PhD. Quantitative immunoassay: a practical guide for assay establishm

30、ent, troubleshooting, and clinical application.數(shù)學(xué)建模與數(shù)學(xué)實(shí)驗(yàn)—擬合，海軍航空工程學(xué)院青島分院教程.曲線擬合與插值.Stephen P. FitzGerald, etc. Development of a High-Throughput Automated Analyzer Using Biochip Array Technology. Clinical Chemistry