免疫學檢測中的干擾因素

1、免疫學檢測方法中的干擾因素和對策,第二軍醫(yī)大學附屬長海醫(yī)院實驗診斷科,沈 茜,隨著基礎免疫學研究的深入和現(xiàn)代免疫學理論的建立，使大量免疫學檢測技術被不斷地創(chuàng)新、發(fā)明；在臨床疾病診治的應用中也不斷地推陳出新。目前應用免疫學原理檢測的檢驗項目占到三級綜合醫(yī)院檢驗科全部檢驗項目的1／4，醫(yī)療收入約占1／3。這就要求檢驗人員不斷掌握最新的臨床免疫學知識和各種新的檢驗方法，了解檢驗項目的基本原理。,生化,臨檢,要保證實驗結果的正確性和可靠性，必

2、須對實驗整個過程中各個環(huán)節(jié)中的干擾因素有比較清楚的掌握和了解。在本次課中主要討論的是標本本身內(nèi)在因素、以及由于人為因素對標本處理不當?shù)纫鸬耐庠谝蛩?、對免疫檢測結果造成的影響。在了解這些因素的同時，如何在臨床工作中注意和解決這些干擾，以保證結果的準確性。,基本概念,抗原：是一類能刺激機體免疫系統(tǒng)產(chǎn)生特異性免疫應答、并能與相應免疫應答產(chǎn)物（抗體或致敏淋巴細胞）發(fā)生特異性結合的物質。,抗體： 是由抗原刺激B細胞經(jīng)分化增殖形成的漿細胞合成和分

3、泌的，能與相應抗原發(fā)生特異性結合并具有多方面免疫功能的球蛋白。,基本概念,,免疫學檢測就是利用抗原和抗體高度特異性結合的原理而檢測分析微量物質的方法。從20世紀50年代美國學者Berson和Yallow發(fā)明了放射免疫測定技術檢測胰島素起，免疫學檢測技術經(jīng)歷了從定性到定量；從常量分析到微量、超微量分析；從手工檢測到全自動化；從單個標本檢測到高通量檢測等一系列長足的進步。,免疫測定技術均是以標記物示蹤作為基礎，同位素、熒光素、酶是經(jīng)典的三大

4、標記免疫測定技術。這三大標記技術發(fā)展了各種各樣的免疫測定方法，如RIA、ELISA、熒光免疫測定、免疫化學發(fā)光測定等，目前應用這三大標記技術的檢測試劑盒在臨床廣為應用。近年來，作為免疫測定發(fā)展方向的非同位素標記技術以其敏感、安全等倍受關注。,免疫檢測技術- 標記物,標本自身及前處理所造成的干擾因素 －類風濕因子（RF） －嗜異性抗體

5、 －自身抗體 －補體 －纖維蛋白 －溶血或黃疸 －交叉反應物質 －外源性物質,免疫學檢測- 干擾因素,干擾因素和對策- 類風濕因子,患者體內(nèi)存在的類風濕因子能顯著干擾許多免疫學檢

6、測方法，IgM、IgG型RF可以與免疫檢測系統(tǒng)中的捕獲抗體及標記二抗的Fc段直接結合，從而導致檢測結果假陽性或假性升高。RF對不同檢測系統(tǒng)的干擾程度有所差異，影響程度并不與RF的濃度成正比 。目前，在臨床工作中使用的免疫檢測試劑盒大部分均沒有很好地防止RF干擾的措施，國外著名公司要好于國內(nèi)公司。,干擾因素和對策- 類風濕因子,收集10份RF31～＞1000IU/L的患者血清，在美國和歐洲66各臨床實驗室進行74個項目的免疫競爭法或免疫夾

7、心法檢測，儀器和試劑均配套。3445個結果中8.7％為假陽性。錯誤高值結果中的21％（所有結果的1.8％）引起了臨床的錯誤診斷，在使用RF吸附劑后再檢測，錯誤結果得到糾正。39％的假陽性結果也可在使用RF吸附劑后降低。,Clinical Chemistry 2002;48(11):2008~2016,RF的干擾－對策,捕獲抗體用F(ab`)2替代完整的IgG 標本用連有熱變性（63℃，10 min）IgG的 固相吸附劑（Eur

8、oimmune公司）處理（將 熱變性IgG加入到標本稀釋液或血清中同樣 有效），4℃過夜離心后在檢測； 檢測抗原時，可以用終濃度0.1mol/L 2-巰 基乙醇(2- ME)等加入到標本稀釋液或標本 中，使RF（IgM型）降解。,干擾因素和對策- 嗜異性抗體,,嗜異性抗體通常是指與其他種類動物的免疫球蛋白產(chǎn)生反應的人類抗體，具有廣泛的種特異性。免疫檢測系統(tǒng)中大量使用單克隆抗體，嗜異性抗體可與嚙齒類動物I

9、gG的Fc段結合。這樣嗜異性抗體既可與檢測系統(tǒng)中的捕獲抗體結合、又可和標記抗體結合，造成檢測結果假陽性或假性升高。嗜異性抗體干擾的程度、頻率與患者的疾病狀態(tài)、年齡、性別等無關。,干擾因素和對策- 嗜異性抗體,,將11261份血清標本使用熒光時間分辨免疫分析系統(tǒng)（PE公司，二步法、雙位點）檢測CEA，將緩沖液中加入小牛IgG 約210個病人、3.3~4.7%的標本出現(xiàn)假性升高；加入15mg/L熱處理小鼠IgG（MAK33 ）（Roche）

10、可將干擾降為0.86%；同濃度天然小鼠IgG無效；去除捕獲抗體或標記抗體的Fc段也可將干擾降至0.1%。,Clinical Chemistry 2002；48(4):613~621,表1. 不同處理方法對嗜異性抗體干擾的排除,干擾因素和對策- 嗜異性抗體,使用Access免疫化學發(fā)光檢測系統(tǒng)測定TSH、PSA、βHCG和皮質醇，前三項為雙位點非競爭法，后為競爭法。160份標本測定HCG有5份（3.1%)假性升高；53份標本（37.9%)

11、用嗜異性抗體吸附劑吸收后結果出現(xiàn)差異性下降；有4份標本的結果出現(xiàn)＞4SD的顯著增高，使臨床對結果的解釋出現(xiàn)改變。,Clin Chem 2003；49(7):1163～1169,嗜異性抗體的干擾－對策,在標本稀釋液或待檢標本中加入過量的動 物Ig (s) ，但加入量不足或亞型不同時無 效（要與捕獲抗體和標記抗體的Ig亞型相 同）。 捕獲抗體使用F(ab`)2，切除Fc段。,干擾因素和對策- 自身抗體,嗜靶抗

12、原的自身抗體，如抗甲狀腺球蛋白、抗胰島素等嗜靶抗原的自身抗體，能與靶抗原結合形成復合物，在免疫檢測系統(tǒng)中均可對靶抗原的測定結果造成負性干擾。 判斷嗜靶抗原的自身抗體對檢測的負干擾，因緊密結合患者的疾病診斷、病史、其他實驗檢查的結果綜合分析。如甲亢、甲低、I型糖尿病等。,Erikssion等人采用針對cTnI中心穩(wěn)定區(qū)域抗原位點的捕獲和檢測抗體，開發(fā)了新的cTnI檢測方法，有利于具有cTnI自身抗體等干擾物質的標本。采用新方

13、法和目前一商品化試劑盒共檢測541份胸痛患者的血清，其中13.5%的標本cTnI兩種方法檢測均陽性，14.2 %的標本僅采用新方法檢測陽性 。上述結果說明心梗患者存在cTnI自身抗體絕非特例 。,干擾因素和對策- 自身抗體,Clin Chem 2005;51(5):848-55,嗜靶抗原自身抗體的干擾－對策,為避免以上情況出現(xiàn)，解決的辦法是：測定前標本需用理化方法將免疫復合物解離后再測定。解離液組成：

14、 0.3%Triton X－100 1.5%CHAPS 15%SDS100μl標本、50 μl解離液混勻，56℃ 30分鐘處理。,J Clin Microbiol 1999;37:1802～1808,干擾因素和對策- 補體,免疫檢測系統(tǒng)中捕獲抗體在向固相包被中和標記抗體的標記過程中，抗體分子發(fā)生變構，其Fc段的補體C1q分子結合位點被暴露出來，使C1q 可以將

15、二者連接起來，從而造成假陽性。一些公司為了增加檢測的敏感性，使用鏈霉親和素包被固相，將捕獲抗體用親和素標記，此過程也可引起捕獲抗體的構象發(fā)生改變 ，造成假陽性或假性升高。,補體的干擾－對策,用終濃度10～40mmol/L EDTA處理標本，滅活補體。 用53℃、10 min或56℃、30 min加熱血清使C1q滅活。,干擾因素和對策- 纖維蛋白,在沒有促凝劑和抗凝劑存在的情況下，正常血液采集后1/2開始凝固，2h后完全凝固。臨床檢驗工

16、作中，有時為了爭取時間快速檢測，常在血液還未開始凝固時或未完全凝固時即強行離心分離血清，此時血清中仍殘留部分纖維蛋白原，在免疫檢測過程中可以形成肉眼可見的纖維蛋白塊，易造成假陽性結果，尤其是在使用ELISA檢測時。,干擾因素和對策-纖維蛋白,用Abbott AxSYM分析了3962份血標本中cTnI 水平，其中307份cTnI升高，將這307份標本再離心前后測定cTnI的變化，24份標本在離心后cTnI有>45%的降低，這種現(xiàn)象主

17、要出現(xiàn)在cTnI含量在2.0~25µg/L的標本。離心后其中20份樣本cTnI值低于正常cutoff值。,Int J Cardiol 2005;101(1):27-31,為避免上述干擾作用，解決的辦法最好是 血液標本采集后必須使其充分凝固再分離血清，或標本采集時用帶分離膠的采血管或于采血管中加入適當?shù)拇倌齽?。懷疑檢測結果存在纖維蛋白干擾的標本，最好將標本4～10℃放置過夜，離心后再檢測。,纖維蛋白的干擾－對策,干擾因素和對策

18、- 溶血或黃疸,各種人為原因引起的標本溶血，導致紅細胞的破壞，血紅蛋白以及細胞碎片和蛋白質等釋放出來。溶血對免疫檢測的作用不僅是游離血紅蛋白的影響，更多的是細胞碎片和蛋白質等其他溶血產(chǎn)物；血紅蛋白具有過氧化物酶活性，在以辣根過氧化物酶為標記的 ELISA測定中，會導致非特異性顯色 。溶血因測定方法的不同可導致對免疫學檢測的正向或負向干擾，且影響大小也有所差異。,干擾因素和對策- 溶血或黃疸,一項針對溶血對電化學發(fā)光法影響的研究發(fā)現(xiàn)，cT

19、nT測定濃度的負偏倚與血清中血紅蛋白濃度相關，血紅蛋白濃度每增1g/L ，cTnT＞0.1µg/L的可能性下降2.5% 。,Clinical Biochemistry 2004;37(8):398-701,標本中結合膽紅素和未結合膽紅素任一或兩者含量的增高都會對采用免疫學原理的檢測系統(tǒng)產(chǎn)生負干擾。,干擾因素和對策- 交叉反應物質,待檢標本中存在類地高辛、類AFP樣物質等，是一些與檢測的靶抗原有交叉反應的物質。在用多克隆抗體測定

20、抗原時對測定結果影響不大，但在用單克隆抗體測定抗原時 ，如果交叉抗原決定簇正好是所用單克隆抗體相對應的靶決定簇時，會出現(xiàn)假陽性結果。,干擾因素和對策- 外源性物質,外源性物質常常是由于用于免疫測定的血標本采集、貯存等不當所致。 標本受細菌污染： 因菌體中可能含有內(nèi)源性辣根過氧化物酶，被細菌污染的標本在以辣根過氧化物酶為標記的 ELISA測定中，可產(chǎn)生非特異性顯色而干擾測定結果。,標本管中添加物質的影響： 抗凝劑、酶抑制劑（如NaN3

21、可抑制ELISA系統(tǒng)中HRP活性）及分離血清的分離膠等均對免疫檢測有一定干擾作用。應用三種檢測系統(tǒng)分別測定100對同時采集的肌鈣蛋白陽性的血清與肝素抗凝血漿兩組標本，在兩者測定值差異大于20%的結果中，ACS :Centaur cTnI占11%，Elecsys cTnT占9%，AxSYM cTnI占2%，其他的抗凝劑如EDTA抗凝的血漿肌鈣蛋白測定結果也比血清低。,干擾因素和對策- 外源性物質,Clin Chem 2000;46(9):

22、1338-44,干擾因素和對策- 外源性物質,標本保存不當： 在冰箱中保存過久的標本，血清中IgG可聚合成多聚體、AFP可形成二聚體，在間接法ELISA測定中會導致本底過深、甚至造成假陽性；有時抗原或抗體免疫活性減弱，亦可出現(xiàn)假陰性。為克服上述干擾，ELISA測定的血清標本宜為新鮮采集；如不能立即測定，5天內(nèi)測定的血清標本可存放于4℃，1周后測定的血清標本應低溫凍存。,凍存后融解的標本，蛋白質局部濃縮，分布不均，應充分混合后再測定，但混

23、勻時應輕柔，不可強烈振蕩。標本的反復凍融所產(chǎn)生的機械剪切力將對標本中的蛋白等分子產(chǎn)生破壞作用，從而引起假陰性結果。,干擾因素和對策- 外源性物質,操作流程不當－造成結果的改變,我們對HBV血清標志物五項指標僅抗-HBc總抗體單陽性的血清實行了嚴格的復檢措施，發(fā)現(xiàn)初、復檢結果的符合率＜50%。偏差如此之大是無法用實驗人員操作不當解釋的?？?HBc總抗體采用競爭抑制ELISA法檢測, 日常工作中無論標本多少，必然是先加完血清標本后再加抗-

24、HBc-HRP。這樣，血清中的抗-HBc與抗-HBc-HRP存在著明顯的“不公平競爭”。,操作流程不當－造成結果的改變,這種“不公平競爭”對實驗結果的影響有多大？,,,表2. 加樣后放置時間對檢測結果的影響,表3. 在加樣放置時間改變后陰性標本A450nm與結果的關系,表4. 加樣同時加入抗-HBc-HRP放置不同時間對檢測結果的影響,操作流程不當－造成結果的改變,我們將臨床抗-HBc總抗體的加樣方式改為每加入10個標本，立即加入抗-

25、HBc-HRP（時間控制在1min40s左右），直至標本全部加完，再共同37℃溫育30 min。經(jīng)過幾萬例臨床標本的檢驗證實，表明這種加樣方法明顯減少了由于操作流程不當造成的結果假陽性，使檢測結果的真實性得到一定的保證。,操作不當－交叉污染,定性免疫測定已廣泛用于感染性病原體抗原和抗體檢測，目前國內(nèi)應用最廣泛的是ELISA等。由于測定操作和(或)加樣吸頭重復使用的全自動加樣系統(tǒng)的使用，常有標本間的交叉污染所致“拖帶”現(xiàn)象致假陽性結果的出

26、現(xiàn)。標本交叉污染不光是導致假陽性，亦會因為乙肝疫苗的普遍免疫，標本中存在的抗HBs 可使受污染標本中可能存在的HBsAg檢測受抑，而致假陰性。,操作不當－交叉污染,經(jīng)江蘇省防疫站HIV確認中心確認，除E9孔所對應的標本為HIV陽性外，其余均為陰性。將這3份新標本進行ELISA 檢測，結果與印跡法吻合。,操作不當－交叉污染,目前的全自動加樣系統(tǒng)，不管是一次性加樣針還是永久性加樣針，均難以避免樣本的污染問題。特別是當遇到高濃度的抗原或抗體，

27、沿加樣方向被污染的甚至可能不止1 個孔。為了排除這種污染造成的假陽性，建議當同一行/列上（沿加樣方向）出現(xiàn)連續(xù)陽性，并經(jīng)復查仍為陽性時，應同時采取新鮮標本進行檢測來加以證實。,交叉污染- 判斷,當出現(xiàn)交叉污染時,如何從日常檢測結果來判斷假陽性的可能原因以及陰性質控或陽性質控成立，但測定結果中已存在假陽性或假陰性，如何從日常檢測結果來觀察? 在實驗室日常檢測陽性率比值呈正態(tài)分布時，可采用半Levey－Jennings質控圖法

28、；不呈正態(tài)分布時則可用直接概率法。,中華檢驗醫(yī)學雜志 2006, 29(2):173～176,,我科20天HBsAg 陽性率的變化,χ=0.112S=0.01982S=0.0396?+2S=0.1516,質控規(guī)則：當陰性質控樣本為陽性時，不管陽性率測定比值為何，均為失控，所有陽性標本須重新測定。如果陰性質控樣本為陰性，某次測定陽性比值超出+ 2SD，則為失控為1 + 2S規(guī)則。本次結果的陰性結果可根據(jù)陽性質控樣本的情況決定是

29、否可以發(fā)出；所有陽性樣本結果不能發(fā)出，需查找出現(xiàn)陽性率增高的原因并重新檢測。,免疫檢測中值得注意的問題,鉤狀效應(Hook effect),由于待檢標本中抗原濃度的顯著升高,而致捕獲抗體不足所造成的檢測結果假陰性或假低測定值。這種現(xiàn)象可以出現(xiàn)在任何免疫學檢測中，一步法檢測更易見。在我科已出現(xiàn)在： 時間分辨免疫熒光分析法 速率散射免疫比濁法 ELISA

30、（一步法、二步法） 免疫滲透層析法,在臨床檢測中密切關注‘’Hook effect”的幾個項目： 甲胎蛋白（AFP） HBsAg、HBeAg 免疫球蛋白 大便隱血（FOB） CA－125,“Hook

31、effct”的預防和處理,依據(jù)患者的臨床診斷 關注患者的其他實驗室檢查結果 不放過任何異常的測定值或模式 使用免疫滲透層析法快速驗證 盡可能使用二步法進行檢測,處理： 用正常人血清系列10倍稀釋再檢測,免疫檢測中值得注意的問題,檢測使用一種試劑盒、復檢必須使用另一種試劑盒，最好方法學也不一樣。 HBsAg、抗－HBs、HBeAg、抗－HBe的檢測最后可以使用“中和法”來鑒定。 抗－HCV的檢測目前國內(nèi)外的試劑盒單獨使用均