免疫學(xué)應(yīng)用

1、血清蛋白醋酸纖維素薄膜電泳——根據(jù)遷移率分離,操作步驟 標(biāo)記 用鉛筆在薄膜無(wú)光澤面(毛面)一端2cm處 輕畫一細(xì)線 ，并在右上角做好標(biāo)記。浸泡 將醋酸纖維素薄膜毛面向下，在緩沖溶液中浸泡，使其充分浸透。點(diǎn)樣 用鑷子將薄膜置于濾紙上，吸收多余的液體(不要太干），利用載玻片 一側(cè)蘸取樣品，45度角于毛面細(xì)線處點(diǎn)樣。 電泳 將

2、薄膜毛面朝下，置于電泳槽的紗布橋上，點(diǎn)樣端置于負(fù)極； 膜條緊貼紗布，待平衡5min后通電，在U=120V電泳40min。 染色 將薄膜取出后，置于氨基黑10B染色劑中，染色5min。漂洗 將薄膜取出后，移至漂洗液中，漂洗若干次，濾紙吸干。,電泳技術(shù),發(fā)展概念基本原理影響因素種類應(yīng)用,The Nobel Prize in Chemistry 1948Arne Tiseli

3、us,1808年-----俄國(guó)物理學(xué)家Re?ss發(fā)現(xiàn)電泳現(xiàn)象。1937年-----瑞典科學(xué)家Tiselius首先設(shè)計(jì)出世界上第一臺(tái)自由電泳儀，并建立了“移界電泳”分離模式。以電泳作為一種分離技術(shù)，首先證明了血清蛋白是由白蛋白、α1、α2、β和γ球蛋白組成的。 "for his research on electrophoresis and adsorption analysis, especially for his

4、discoveries concerning the complex nature of the serum proteins",發(fā)展,20世紀(jì)50年代，以支持介質(zhì)為主的電泳模式不斷涌現(xiàn)，如濾紙、醋酸纖維素薄膜、淀粉薄膜等。60年代以后發(fā)展了以凝膠為主的支持物的電泳方法，如聚丙烯酰胺凝膠、瓊脂糖凝膠電泳等。1967年在凝膠電泳的基礎(chǔ)上建立了SDS-聚丙烯酰胺凝膠電泳技術(shù)。90年代又推出了分辨率極高的高效毛細(xì)管電泳。如今，

5、各類電泳技術(shù)已廣泛應(yīng)用于生命科學(xué)各個(gè)領(lǐng)域。,基本概念,帶電粒子在電場(chǎng)的作用下，向著與其電性相反的電極移動(dòng)的現(xiàn)象稱為電泳(electrophoresis) 。帶電粒子由于帶電性質(zhì)及電荷量不同，在一定的電場(chǎng)強(qiáng)度下具有不同的移動(dòng)速度及方向。電泳技術(shù)就是根據(jù)各種帶電粒子在電場(chǎng)中遷移速度的不同而對(duì)物質(zhì)進(jìn)行分離的一類實(shí)驗(yàn)技術(shù)。,電泳用于分離物質(zhì)的原理（1）,電荷量及方向：蛋白質(zhì)為例,等電點(diǎn),電泳用于分離物質(zhì)的原理（2）,遷移率：以?來(lái)表示，即單

6、位電場(chǎng)強(qiáng)度時(shí)粒子運(yùn)動(dòng)的速度，取決于帶電粒子的電荷量Q、粒子大小γ和形狀。,電泳用于分離物質(zhì)的原理（3）,具體實(shí)驗(yàn)中：,V:泳動(dòng)速度cm/秒or分d:泳動(dòng)距離cmt:電泳時(shí)間 (秒/分)E:電場(chǎng)強(qiáng)度 伏特/cm,u:泳動(dòng)率or泳動(dòng)度(cm2/伏·秒or分)U:電壓l:支持場(chǎng)的長(zhǎng)度 (有效長(zhǎng)度),設(shè)：混合物中有A、B兩物質(zhì)：,物質(zhì)A在電場(chǎng)中移動(dòng)的距離為: dA= ?AVt/l 物質(zhì)B的移動(dòng)距離為：dB= ?BVt/l

7、 則兩物質(zhì)移動(dòng)距離之差為： Δd=(dA-dB)=(?A-?B)Vt/l即：物質(zhì)A、B能否分離取決于兩者的遷移率,影響電泳速度的因素：內(nèi)因,1.凈電荷：被分離物帶電荷量與電泳速度成正比 2.質(zhì)點(diǎn)大小：顆粒直徑愈小愈快，分子大小與電泳 速度成反比 3.質(zhì)點(diǎn)形狀：球形分子比纖維狀分子泳動(dòng)快。,影響電泳速度的因素：外因（1）,,溶液的pH值 決定帶電粒子的解離的程度，即該物質(zhì)帶

8、凈電荷多少的決定因素。對(duì)蛋白質(zhì)等兩性電解質(zhì)而言，pH值離等電點(diǎn)越遠(yuǎn)，則顆粒所帶凈電荷越多，泳動(dòng)速度也越快，反之，則越慢。 為了使電泳過(guò)程中溶液pH值恒定，必須采用緩沖溶液。一般常用的電泳緩沖液pH范圍在4.5~9.0。,影響電泳速度的因素：外因（2）,溶液的離子強(qiáng)度 維持一定的緩沖容量，需要一定濃度的離子，它主要與其濃度和價(jià)數(shù)相關(guān)。 I=1/2?CiZi2 緩沖液I越大，降低樣品（蛋

9、白質(zhì)）帶電量，泳動(dòng)速度變慢，最后破壞膠體，但區(qū)分條帶清晰。 緩沖液I越小，緩沖容量小，pH不穩(wěn)定，樣品易擴(kuò)散；則泳動(dòng)速度快，條帶分離差。 一般在0.02-0.2。,影響電泳速度的因素：外因（3）,電場(chǎng)強(qiáng)度 是指電場(chǎng)中每厘米的電位降，也稱電位梯度或電勢(shì)梯度。電場(chǎng)強(qiáng)度對(duì)電泳的速度起著重要作用，電場(chǎng)強(qiáng)度高，帶電顆粒泳動(dòng)速度快，電場(chǎng)強(qiáng)度低，帶電顆粒泳動(dòng)速度慢。 電壓越高，產(chǎn)熱增加

10、，高壓電泳需備冷卻裝置。 否則？,影響電泳速度的因素：外因（4）,支持介質(zhì)(1)物理化學(xué)性質(zhì)穩(wěn)定：在電泳過(guò)程中不受環(huán)境因素的影響，保持原有的狀態(tài)和性能。(2)化學(xué)惰性：在電泳過(guò)程中不與緩沖系統(tǒng)中的各種離子和待分離的生物大分子發(fā)生化學(xué)反應(yīng)，不干擾生物大分子的電泳過(guò)程。(3)分布均勻：內(nèi)電滲小，結(jié)果重復(fù)性好。,電滲作用,液體對(duì)固體支持物的相對(duì)移動(dòng)，在電場(chǎng)中，由于多孔支持物吸附水中的正或負(fù)離子使溶液相對(duì)帶電，在電場(chǎng)作用下，溶液帶

11、動(dòng)樣品向一定方向移動(dòng)。,種類：,自由界面電泳區(qū)帶電泳：紙電泳、醋酸纖維素薄膜電泳、粉末電泳、細(xì)絲電泳、凝膠電泳。連續(xù)系統(tǒng)：電荷效應(yīng)、分子篩效應(yīng)不連續(xù)系統(tǒng)：濃縮效應(yīng)、電荷效應(yīng)、分子篩效應(yīng)盤狀平板式垂直板式,,,,電荷效應(yīng)：電荷量不同，遷移率不同。分子篩效應(yīng)：分子量或分子大小和形狀不同的蛋白質(zhì)通過(guò)一定孔徑分離膠時(shí)，受阻滯的程度不同而表現(xiàn)出不同的遷移率，這就是分子篩效應(yīng)。分子量小，阻力小，移動(dòng)快；分子量大，阻力大，移動(dòng)慢。,,

12、電泳技術(shù)的應(yīng)用,分離純化樣品測(cè)定分子量組建物理圖譜鑒定重組體分子雜交測(cè)序PCR檢測(cè)分子標(biāo)記檢測(cè),醋酸纖維素膜：是一種由醋酸纖維加工制成的一種細(xì)密且薄的微孔膜。廣泛應(yīng)用于醫(yī)學(xué)臨床中各種生物分子的分離分析中。（醋酸纖維素薄膜電泳分離血清清蛋白）瓊脂糖凝膠：一般用于核酸的分離分析。瓊脂糖凝膠孔徑度較大，對(duì)大部分蛋白質(zhì)只有很小的分子篩效應(yīng)。聚丙烯酰胺凝膠：可用于核酸和蛋白質(zhì)的分離、純化及檢測(cè)。其分辨率較高。（等電聚焦電泳分離血

13、紅蛋白和細(xì)胞色素C） 聚丙烯酰胺和瓊脂糖是目前實(shí)驗(yàn)室最常用的支持介質(zhì)。,,電泳介質(zhì)：,,原理：以醋酸纖維素薄膜為支持物，在PH=8.6的巴比妥緩沖液中，血清蛋白的PI均小于8.6，帶負(fù)電荷，電泳時(shí)向正極移動(dòng)。由于遷移率不同而被分離。,醋酸纖維素薄膜電泳分離血清蛋白,,,,表-1 血清中各蛋白質(zhì)的相關(guān)特性,種 類,分子量(萬(wàn)）,PI,分 布(%),清蛋白,?1-球蛋白,?2-球蛋白,?-球蛋白,?-球蛋白,6.9,5.0,

14、9.0,13.0,11.0,4.8,5.0,5.0,5.2,6.8-7.5,55,2.1~30.8,4.1~72.5,1.2~25,15.6,蛋白質(zhì)染料——氨基黑10B 酸性染料，其磺酸基與蛋白質(zhì)反應(yīng)構(gòu)成復(fù)合鹽，是最常用的蛋白質(zhì)染料。這類染料對(duì)不同的蛋白質(zhì)結(jié)合量不同，染色不均一和高背景影響蛋白質(zhì)的定量。染色靈敏度較低，現(xiàn)在這類染料已很少應(yīng)用，被靈敏度較高的考馬斯亮藍(lán)所代替。,優(yōu)缺點(diǎn),醋酸纖維薄膜廣泛應(yīng)用于醫(yī)學(xué)臨床中各種生物分子的

15、分離分析中，如血清蛋白、血紅蛋白、球蛋白、脂蛋白、糖蛋白、甲胎蛋白、類固醇及同工酶等。它具有簡(jiǎn)單快速、對(duì)蛋白質(zhì)樣品吸附極少，無(wú)“拖尾”現(xiàn)象，染色后蛋白質(zhì)區(qū)帶更清晰等優(yōu)點(diǎn)，電滲作用雖然較高但很均一 ，不影響樣品的分離效果。不足之處是分辨率比聚丙烯酰胺凝膠電泳低，由于薄膜厚度?。s10～100μm），樣品用量很少，不適于制備。,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,前清蛋白,清蛋白,?-球蛋白,?-球蛋白,臨床意義：,,白蛋白：

16、主要在肝臟合成，所以與肝臟疾患密切相關(guān)。α球蛋白的增加與發(fā)熱有關(guān)，與炎癥有關(guān)。β球蛋白增加常伴隨血中脂質(zhì)的增加。γ球蛋白含有抗體成分，在許多慢性感染、免疫性疾病中有異常。例如：多發(fā)性骨髓瘤病人在β球蛋白與γ球蛋白之間出現(xiàn)一個(gè)尖峰：M蛋白 肝硬化病人γ球蛋白增加，白蛋白降低。,思考題,預(yù)習(xí)：實(shí)驗(yàn)五、六,凝膠層析分離蛋白質(zhì)混合物的原理？何謂分子篩效應(yīng)？DNS—氨基酸的雙向聚酰胺薄膜層析中，各種氨基酸是怎