免疫學檢驗中的酶免疫技術(shù)

1、免疫學檢驗中的酶免疫技術(shù)免疫學檢驗中的酶免疫技術(shù)20世紀中期，以放射免疫技術(shù)為代表的標記免疫技術(shù)相繼問世，它將某種可微量或超微量測定的物質(zhì)（如放射性核素、熒光素、酶、化學發(fā)光劑等）標記于抗原（抗體）上制成標記物，加入到抗原抗體的反應體系中與相應的抗體（抗原）反應，以檢測標記物的有無及含量間接反映被測物的存在與多少。這些將標記技術(shù)與抗原抗體反應結(jié)合起來的免疫學檢測技術(shù)以其敏感性高、準確性好、操作簡便、易于商品化和自動化等特點逐漸替代了凝集

2、、沉淀等經(jīng)典的免疫學檢驗技術(shù)，不僅用于抗原、抗體、補體、免疫細胞、細胞因子等免疫相關(guān)物質(zhì)的檢測，也用于酶、微量元素、激素、微量蛋白等體液中各種微量物質(zhì)的檢查，可以說一切具有抗原性或半抗原性的物質(zhì)原則上均可利用現(xiàn)代免疫檢驗技術(shù)進行檢測，使免疫學檢驗滲透到醫(yī)學的各個領(lǐng)域。目前，免疫學檢驗中的標記技術(shù)主要包括酶免疫技術(shù)、熒光免疫技術(shù)、放射免疫技術(shù)、金免疫技術(shù)、化學發(fā)光免疫技術(shù)等。其中酶免疫技術(shù)是以酶標記的抗體（抗原）作為主要試劑，將抗原抗體反

3、應的特異性和酶催化底物反應的高效性和專一性結(jié)合起來的一種免疫檢測技術(shù)。作為經(jīng)典的三大標記技術(shù)之一，酶免疫技術(shù)在檢驗醫(yī)學中得到廣泛應用并不斷得到更新。一、常用的酶及顯色底物在酶免疫技術(shù)中用于標記的酶應具有催化活性高、催化專一性強；與抗原抗體偶聯(lián)后不影響抗原抗體的免疫反應性和酶活性；催化的底物易于配制、保存且催化底物產(chǎn)生的信號產(chǎn)物易于觀察和檢測；對人無害且價廉、易得等特點，目前常用的酶及底物見表1。表1常用酶及底物常用酶常用酶底物底物加終止

4、液前顏色加終止液前顏色加終止液后顏色加終止液后顏色辣根過氧化物酶辣根過氧化物酶（HRP）RZ3.1堿性磷酸酶（堿性磷酸酶（AP）鄰苯二胺（OPD）四甲基聯(lián)苯胺（TMB）對硝基苯磷酸酯（pNPP）橙黃色藍色黃色棕黃色黃色黃色二、標記物的制備在酶免疫技術(shù)中制備標記物的抗原應純度高、抗原性完整；制備標記物的抗體應特異性好、效價高、親和力強、比活性高、能批量生產(chǎn)和易于分離純化。制備酶標記物的方法應符合簡單、產(chǎn)量高；避免酶、抗體（抗原）、酶標記物

5、各自形成聚合物；標記反應不影響酶的活性和抗原抗體的免疫反應性等原則。標記物制備的方法基本屬于兩類：（一）交聯(lián)法交聯(lián)法是以一可同時與酶和抗體（抗原）結(jié)合的交聯(lián)劑作為“橋”，分別連接酶與抗體（抗原）的方法，此類方法中目前最常用的是戊二醛交聯(lián)法，形成的結(jié)合物為：酶戊二醛抗體（抗原）（二）直接法直接法是用一活化劑首先將酶活化，被活化的酶分子上的基團直接可與抗體（抗原）結(jié)合形成標記物，如過碘酸鈉法。形成的結(jié)合物為：酶抗體（抗原）。結(jié)合的標記物都存

6、在于液相中，故需用分離劑將二者分開后才能測定結(jié)合狀態(tài)的酶標記物的活性。而固相酶免疫測定，是通過載體將結(jié)合狀態(tài)的酶標記物吸附在固相支持物上，只需洗滌就可將游離的酶標記物去除。目前固相酶免疫測定以酶聯(lián)免疫吸附試驗（ELISA）為最常用。一、酶聯(lián)免疫吸附試驗（ELISA）（一）基本原理酶聯(lián)免疫吸附試驗的基本原理是將過量抗體（抗原）包被于載體上，通過抗原抗體反應使酶標記抗體（抗原）也結(jié)合在載體上，經(jīng)洗滌去除游離的酶標記抗體（抗原）后，加入底物顯

7、色，定性或定量分析有色產(chǎn)物確定待測物的存在與含量的檢測技術(shù)。（二）技術(shù)類型酶聯(lián)免疫吸附試驗的主要技術(shù)類型有雙抗體夾心法、間接法、競爭法、捕獲法等。1各種技術(shù)類型的原理如下：雙抗體夾心法用于檢測抗原。它是利用待測抗原上的兩個抗原決定簇A和B分別與固相載體上的抗體A和酶標記抗體B結(jié)合，形成抗體A待測抗原酶標抗體B復合物，復合物的形成量與待測抗原含量成正比，屬非競爭性反應類型。間接法用于測定抗體。它的原理是將已知抗原連接在固相載體上，待測抗體

8、與抗原結(jié)合后再與酶標二抗結(jié)合，形成抗原待測抗體酶標二抗的復合物，復合物的形成量與待測抗體量成正比，屬非競爭性反應類型。競爭法既可用于檢測抗原又可用于檢測抗體。它是用酶標抗原（抗體）與待測的非標記抗原（抗體）競爭性的與固相載體上的限量抗體（抗原）結(jié)合，待測抗原（抗體）多，則形成非標記復合物多，酶標抗原與抗體結(jié)合就少，也就是酶標記復合物少，因此，顯色程度與待測物含量成反比。捕獲法用于測定IgM類抗體。固相載體上連接的是IgM的二抗，先將標本

9、中的IgM類抗體捕獲，防止IgG類抗體對IgM測定的干擾，此步驟也是其稱為捕獲法的原因所在，然后再加入特異抗原和酶標抗體，形成抗體IgMIgM特異抗原酶標抗體的復合物，復合物含量與待測IgM成正比，也屬非競爭性反應類型。2.各種技術(shù)類型的主要區(qū)別：見表2。表2ELISA常用技術(shù)類型比較類型類型固相載體上固相載體上的包被物的包被物待測物待測物酶標記物酶標記物顯色程度與待顯色程度與待測物含量間的測物含量間的關(guān)系關(guān)系雙抗體夾心法雙抗體夾心法（