禽白血病抗原和抗體ELISA檢測方法的建立.pdf

1、禽白血病(Avian Leukosis)是由禽白血病病毒(Avian Leukosis Virus)引起的一種易傳染的腫瘤性疾病。ALV能夠引起雞群患腫瘤性疾病，除了對雞群造成直接危害外，還可導(dǎo)致雞群免疫失敗，繼發(fā)感染，產(chǎn)蛋率降低等，給我國養(yǎng)禽業(yè)帶來了巨大的損失。到目前為止，該病還沒有研制出可用的疫苗和有效的治療藥物，只能采取凈化措施控制病毒的傳播。P27蛋白為ALV的衣殼蛋白、群特異性抗原，目前常運用ELISA方法監(jiān)測P27抗原達到凈

2、化雞群的目的。本研究中在原核表達技術(shù)的基礎(chǔ)上制備重組P27蛋白，建立檢測P27抗體的間接ELISA方法，并同時將P27蛋白作為免疫原免疫Balb/c小鼠和日本大耳白兔，分別制備單克隆抗體和多克隆抗體，建立檢測P27抗原的夾心ELISA檢測方法，為禽白血病的臨床快速診斷提供了有效工具。
　　 具體內(nèi)容包括:
　　 1.P27基因的原核表達
　　 ALV P27基因克隆至原核表達載體pET28a，構(gòu)建pET28a-P

3、27重組質(zhì)粒，將其轉(zhuǎn)化大腸桿菌BL21(DE3)，經(jīng)IPTG16℃過夜誘導(dǎo)獲得以可溶形式高效表達的P27蛋白，對P27蛋白進行鎳親和層析純化，并經(jīng)SDS-PAGE以及western blot證明，該P27蛋白的純化效果好，具有與雞陽性血清反應(yīng)的免疫原性。
　　 2.禽白血病病毒P27蛋白間接ELISA檢測方法的建立
　　 以P27蛋白為包被抗原，辣根過氧化物酶（HRP）標記的羊抗雞IgY作為二抗，建立禽白血病抗體間接EL

4、ISA檢測方法。通過方陣滴定實驗和各種優(yōu)化條件的摸索，最終確定P27蛋白的包被濃度為0.183μg/mL，血清稀釋度為1∶500，HRP標記的羊抗雞IgY稀釋度為1∶60000。經(jīng)試驗結(jié)果證明，該方法具有特異性好、敏感性高和重復(fù)性穩(wěn)定等特點。該方法可用于ALV所有亞群抗體的檢測，與IDEXX AB亞群和IDEXXJ亞群抗體檢測試劑盒的總符合率為85.7％。
　　 3.P27蛋白單克隆抗體的制備及鑒定
　　 以純化的P27

5、蛋白為免疫原，按照常規(guī)方法免疫6-8周齡的Balb/C小鼠，取該小鼠的脾細胞與SP2/0細胞融合，通過細胞培養(yǎng)和有限稀釋法制備單克隆抗體，最終獲得6株能夠特異性結(jié)合原核表達的P27蛋白的雜交瘤細胞株。經(jīng)生物學(xué)特性分析，雜交瘤細胞染色體數(shù)均為90條左右。經(jīng)間接免疫熒光鑒定2F3、5C2和5C7株單抗能與ALV發(fā)生特異性結(jié)合。
　　 4.P27蛋白多克隆抗體的制備及鑒定
　　 以純化的P27蛋白為免疫原，按常規(guī)方法免疫日本大

6、耳白兔，免疫效價達到1∶64000。采取兔血清，對血清進行純化，制備多克隆抗體。經(jīng)試驗驗證，該多克隆抗體純化效果較好，能夠和ALVP27蛋白特異性結(jié)合。
　　 5.禽白血病病毒P27蛋白夾心ELISA檢測方法的建立
　　 將2F3株單抗作為捕獲抗體，P27多抗作為檢測抗體，HRP標記的羊抗兔IgG為二抗，建立檢測禽白血病抗原的夾心ELISA檢測方法。通過方陣滴定實驗和各種優(yōu)化條件的摸索，最終確定2F3株單抗的包被濃度為0