金磁微粒為載體的乙肝病毒表面抗原免疫學(xué)檢測(cè)方法的建立.pdf

1、乙型病毒性肝炎是由乙型肝炎病毒(Hepatitis B virus，HBV)所引起的世界范圍的傳染性疾病，其包膜蛋白乙肝表面抗原(Htepatitis B surface antigen，HBsAg)是感染HBV的重要標(biāo)志。目前臨床檢測(cè)血清(漿)中HBsAg常用以酶標(biāo)板為載體雙抗體夾心EUSA法。 磁分離酶聯(lián)免疫測(cè)定法(Magnetic affinity immunoassay，MAIA)是20世紀(jì)80年代出現(xiàn)的一種檢測(cè)方法。將

2、酶聯(lián)免疫檢測(cè)系統(tǒng)與磁性微粒分離系統(tǒng)相結(jié)合，具有高敏感性、高特異性、無污染、無毒性、操作簡(jiǎn)便和樣品用量少等優(yōu)點(diǎn)。本研究以新型磁性復(fù)合微粒一金磁微粒(Fe<,3>O<,4>/Au微粒)為載體，建立了HBsAg檢測(cè)的磁分離酶聯(lián)免疫法。即將抗乙肝病毒表面抗原的單克隆抗體(Anti-HBsMcAb)包被于金磁微粒的表面，加入對(duì)照血清，再加入辣根過氧化物酶(HRP)標(biāo)記的抗乙肝病毒表面抗原多克隆抗體(Anti-HBs PcAb-HRP)， 37。C

3、孵育25 min，形成雙抗體夾心復(fù)合物，引入TMB底物后，復(fù)合物上的酶則催化底物顯色，最后通過酶標(biāo)儀檢測(cè)顯色液的吸光度值來檢測(cè)HBsAg的濃度。通過標(biāo)準(zhǔn)HBsAg血清盤對(duì)該方法進(jìn)行了驗(yàn)證和比較。結(jié)果表明，磁分離酶聯(lián)免疫法的批內(nèi)及批間相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差較小(1.20～7％)；乙肝病毒表面抗原adr，adw，ay三種亞型的最低檢出濃度分別為0.5 ng/mL，0.5 ng/mL及1.0 ng/mL，其靈敏度與目前商品化ELISA試劑盒的檢測(cè)結(jié)果相

4、當(dāng)；用本法對(duì)203份血樣進(jìn)行檢測(cè)，結(jié)果與商品化ELISA試劑盒的檢測(cè)結(jié)果完全一致。 化學(xué)發(fā)光免疫分析法(Chemiluminescence immunoassay，CLIA)具有極高的靈敏度和較寬的線性范圍，將其引入到磁分離酶聯(lián)免疫系統(tǒng)中可進(jìn)一步提高方法的靈敏度。因此本實(shí)驗(yàn)引入I．uminol-H<,2>O<,2>-HRP發(fā)光體系，通過對(duì)碘苯酚(PIP)對(duì)化學(xué)發(fā)光增強(qiáng)，建立了檢測(cè)HBsAg的磁分離酶聯(lián)免疫化學(xué)發(fā)光法。通過條件優(yōu)化

5、，選擇HRP標(biāo)記抗體的稀釋度為1：1000，溫育時(shí)間為25 min，以0.1 mol/L CBS緩沖液(pH 9.5)為化學(xué)發(fā)光緩沖介質(zhì)，選擇魯米諾、過氧化氫及對(duì)碘苯酚的濃度分別為5×10<'-4>mol/L，1×10<'-3>mol/L和1×10<'-3>mol/L，建立了HBsAg的濃度與其相對(duì)發(fā)光光子數(shù)值之間的標(biāo)準(zhǔn)曲線，結(jié)果顯示，線性良好，R<'2>=0.996，線性范圍為4～1100 pg/mL，檢測(cè)限為8.6x10<'-4>n

6、g/mL，比目前商品化試劑盒(檢測(cè)限通常為0.5～1 ng/mL)的靈敏性提高了1000倍。在線性范圍內(nèi)選取濃度為4×10<'-10>g/mL，的HBsAg標(biāo)準(zhǔn)品，重復(fù)測(cè)定11次，其測(cè)定值的相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差(RSD)為6.8％。以上的研究工作表明以金磁微粒為載體的HBsAg免疫學(xué)檢測(cè)方法具有靈敏度高，操作簡(jiǎn)單、快速，結(jié)果可靠等優(yōu)點(diǎn)，與化學(xué)發(fā)光免疫分析法結(jié)合后還可實(shí)現(xiàn)對(duì)HBsAg的高靈敏度定量檢測(cè)，因而在血站篩查及臨床檢測(cè)領(lǐng)域有較好的應(yīng)用前景