高敏乙肝病毒檢測(cè)臨床意義

1、高敏HBV檢測(cè)臨床意義及產(chǎn)品考評(píng)工作匯報(bào),珀金埃爾默醫(yī)學(xué)診斷孫祥杰 電話：15202126516,Our mission 愿景...,...for a healthier today and an even better tomorrow,,,,,,,Dedicated to improving the health and safety of people and the e

2、nvironment致力于改善人類的健康和促進(jìn)我們生活環(huán)境的安全,國(guó)際治療路線,HBV優(yōu)化治療路線圖策略,* 由美國(guó)坦福大學(xué)醫(yī)學(xué)中心Keeffe教授（專家組）提供,各指南推薦的治療終點(diǎn),美肝會(huì)指南,2008年美國(guó)肝病協(xié)會(huì)CHB防治指南：持久消除HBV是乙肝的治療終點(diǎn)，HBV DNA病毒載量盡可能小于或等于10 IU/ ml。,歐洲肝病研究學(xué)會(huì)EASL2010年指南指出：將HBV DNA病毒載量盡可能控制在10-15 IU/ ml

3、，能有效防止疾病的復(fù)發(fā)。,歐肝會(huì)指南,乙型肝炎病毒定量檢測(cè)試劑注冊(cè)申報(bào)技術(shù)指導(dǎo)原則,《乙型肝炎病毒（HBV）DNA定量檢測(cè)試劑注冊(cè)申報(bào)技術(shù)指導(dǎo)原則》,行業(yè)標(biāo)準(zhǔn),專家意見,莊輝、魯鳳民等，《慢性乙型肝炎病毒DNA定量檢測(cè)的臨床意義》2012年,臨床一線對(duì)超靈敏檢測(cè)試劑需求旺盛,,傳統(tǒng)定量產(chǎn)品滿足不了臨床需求,臨床用核酸提取試劑,乙肝定量kit48測(cè)試/盒國(guó)食藥監(jiān)械（準(zhǔn)）字2013第3402077號(hào)2013年11月,丙肝定量kit2

4、4測(cè)試/盒國(guó)食藥監(jiān)械（準(zhǔn)）字2011第3400554號(hào)2011年5月,核酸提取kit32測(cè)試/盒滬青械備20140045號(hào)2014年12月,,,,,,高靈敏：HBV 檢測(cè)下限：20 IU/ml (2013年11月已拿到新證)HCV 檢測(cè)下限：15 IU/ml (預(yù)計(jì)16年3月拿到新證),國(guó)家CFDA技術(shù)審評(píng)中心《HBV DNA/HCV RNA 定量試劑技術(shù)審評(píng)指導(dǎo)原則》中指出： HBV DNA最低

5、檢測(cè)限應(yīng) ≤30IU/ml HCV RNA最低檢測(cè)限應(yīng) ≤50IU/ml,PKI臨床高敏定量檢測(cè)產(chǎn)品,,,,,,HBV產(chǎn)品性能,高敏乙肝試劑對(duì)比試驗(yàn)開展單位,北京大學(xué)醫(yī)學(xué)部上海仁濟(jì)醫(yī)院湖北省人民醫(yī)院上海第三人民醫(yī)院溫州醫(yī)科大附屬第一醫(yī)院東營(yíng)勝利油田中心醫(yī)院昆明醫(yī)學(xué)院第一附屬醫(yī)院滄州傳染病醫(yī)院中山大學(xué)附屬第一醫(yī)院北京三零二醫(yī)院,高敏乙肝試劑對(duì)比試驗(yàn)開展單位,浙江PCR培訓(xùn)班現(xiàn)場(chǎng)評(píng)價(jià)重慶PCR培訓(xùn)班現(xiàn)場(chǎng)評(píng)

6、價(jià)廣州PCR培訓(xùn)班現(xiàn)場(chǎng)評(píng)價(jià)煙臺(tái)PCR培訓(xùn)班現(xiàn)場(chǎng)評(píng)價(jià),一、北大醫(yī)學(xué)部,臨床血清盤評(píng)價(jià),線性范圍評(píng)價(jià),Day 1:,Genotype A Panel: WHO HBV Standard（NIBSC code: 10/264）稀釋均采用HBV 陰性人EDTA抗凝血漿：HBsAg negative and anti-HBcAb negative,Day 2 & 3: repeat the above testing pattern

7、,1. WHO 標(biāo)準(zhǔn)血清盤可溯源性檢測(cè)方案,,該HBV定量試劑具有良好的溯源性,PKI HBV定量試劑對(duì)WHO標(biāo)準(zhǔn)品溯源性檢測(cè)結(jié)果,靈敏度 WHO標(biāo)準(zhǔn)品（A亞型）,Day 1:,Genotype B:衛(wèi)生部臨床檢驗(yàn)中心（GBW09150）Genotype C:中國(guó)藥品生物制品檢定研究院Genotype D: SeraCare公司（ WWHD301-10 ）,Day 2 & 3: repeat the above testi

8、ng pattern,2. HBV B/C/D亞型的重復(fù)性比較方案,PKI HBV定量試劑對(duì)HBV B/C/D亞型標(biāo)準(zhǔn)血漿檢測(cè)精密度評(píng)價(jià),該HBV定量試劑具有良好的重復(fù)性,,,,,,,重復(fù)性 臨檢中心標(biāo)準(zhǔn)品（B亞型）,3. 線性范圍評(píng)價(jià)方案,改良Doumas法,該試劑的線性范圍可達(dá)到（20~1E+09）IU/ml,線性范圍分析,改良Doumas法,線性范圍圖,4. 臨床血清盤評(píng)價(jià),,雙盲法對(duì)比測(cè)試84例臨床樣本符合率100%其中2

9、例樣本低于兩種檢測(cè)試劑的檢測(cè)下限20 IU/ml，兩種試劑均可檢出。Deming regression（圖）分析結(jié)果顯示：兩中試劑的相關(guān)性較好（r=0.968，p<0.0001）；二者關(guān)系為PKI=0.340+0.975*Roche；,Correlation with Roche,該HBV定量檢測(cè)試劑在溯源性、精密度及線性范圍方面均有良好表現(xiàn)，臨床樣本檢測(cè)與進(jìn)口試劑具有良好的相關(guān)性。,試劑考評(píng)結(jié)論,二、上海仁濟(jì)醫(yī)院,Genoty

10、pe A Panel: WHO HBV Standard（NIBSC code: 10/264）稀釋均采用HBV 陰性人EDTA抗凝血漿：HBsAg negative and anti-HBcAb negative,1. WHO 標(biāo)準(zhǔn)品準(zhǔn)確度檢測(cè)方案,該HBV定量試劑具有良好的溯源性和準(zhǔn)確度,PKI HBV定量試劑準(zhǔn)確度檢測(cè)結(jié)果,,Day 2 & 3 & 4: repeat the above testing patt

11、ern,2. 重復(fù)性比較方案,Day 1: 直接測(cè)試16次,批內(nèi)重復(fù)性檢測(cè)結(jié)果,該HBV定量試劑具有良好的重復(fù)性,,(Coefficient of Variance),批間重復(fù)性檢測(cè)結(jié)果,該HBV定量試劑具有良好的重復(fù)性,,3. 線性范圍評(píng)價(jià)方案,改良Doumas法,該試劑的線性范圍可達(dá)到（20~1E+09）IU/ml,線性范圍分析,Correlate,4. 臨床樣本評(píng)價(jià)方案,8次方濃度樣本8個(gè),PKI,3次方濃度樣本8個(gè),7次方濃度樣

12、本8個(gè),2次方濃度樣本8個(gè),6次方濃度樣本8個(gè),5次方濃度樣本8個(gè),4次方濃度樣本8個(gè),1次方濃度樣本8個(gè),Roche,對(duì)比,,臨床對(duì)比結(jié)果,臨床對(duì)比結(jié)果,5. 檢測(cè)限評(píng)價(jià)方案,Genotype A Panel: WHO HBV Standard（NIBSC code: 10/264）稀釋均采用HBV 陰性人EDTA抗凝血漿：HBsAg negative and anti-HBcAb negative,Repeat 3,Repeat

13、4,檢測(cè)限結(jié)果,,,,三、湖北省人民全血測(cè)評(píng)結(jié)果 on Chemagic 360,相對(duì)于過柱法提取，磁珠方法提取全血有更高的得率,湖北省人民全血測(cè)評(píng)結(jié)果 on Chemagic 360,將全血原倍樣本重復(fù)提取3次測(cè)試，并稀釋5倍、10倍測(cè)試，結(jié)果表明磁珠方法提取全血具有更好的重復(fù)性、梯度關(guān)系,湖北省人民全血測(cè)評(píng)結(jié)果 on Chemagic 360,四、北京302醫(yī)院—精密度,四、北京302醫(yī)院—臨床樣本對(duì)比,四、北京302醫(yī)院—

14、棋盤交叉污染測(cè)評(píng),Unbeatable Solution,Magnet offRotation on,Magnet on,Magnetic Beads based on (PVA),~ 1 µm,,chemagic Separation Technology,BloodSaliva / SwabsPlasma(Pathogens),Standard Kits for:,Pre-NAT技術(shù)特點(diǎn)-3,轉(zhuǎn)移磁珠而不采用轉(zhuǎn)移液

15、體的方式進(jìn)行核酸提取，可以有效的減少氣溶膠的產(chǎn)生幾率，具有良好的防污染效果，而且可以極大的減少樣本處理時(shí)間。,用旋轉(zhuǎn)磁棒的方式進(jìn)行液體攪拌，從而確保磁珠完全重懸并釋放雜質(zhì)。能夠避免磁棒振動(dòng)模式混勻、或者吹吸混勻的氣溶膠產(chǎn)生的風(fēng)險(xiǎn)。通過電磁鐵控制磁場(chǎng)，磁珠被轉(zhuǎn)移到下一個(gè)提取組分中，無需轉(zhuǎn)移液體。,防污染措施,1. 紫外燈消毒，有效防止交叉污染。2. 磁棒旋轉(zhuǎn)式混勻，液面上升幅度小，可防止液體噴濺。3. 轉(zhuǎn)移磁珠的方法，減少了液體/氣溶

16、膠暴露的機(jī)會(huì)，從而減少污染。4. 廢棄槍頭處理方式：直接打到專用垃圾袋，防止含病原體的槍頭污染臺(tái)面。5. 每次實(shí)驗(yàn)后進(jìn)行儀器清潔：75%酒精擦拭臺(tái)面。6. 使用濾芯槍頭。7. MSM1排風(fēng)口引到pre-NAT外部，防止氣流回流造成污染。8. 設(shè)有移液回吸動(dòng)作，防止陽性樣本滴出造成污染。,表1 相對(duì)符合率分析,五、與國(guó)內(nèi)煮沸法HBV 低于500 IU/ml 樣本結(jié)果測(cè)評(píng)分析,簡(jiǎn)要分析：國(guó)產(chǎn)試劑HBV PCR試劑20IU/ml濃

17、度以上假陰性率達(dá)到64%以上，且個(gè)別結(jié)果達(dá)到E4 E5高濃度樣本漏檢；,可見普通煮沸法HBV 定量試劑臨床漏檢率特別高，給臨床診治帶來錯(cuò)誤的診斷治療依據(jù)。,表2 相對(duì)符合率分析,與一步法 HBV PCR試劑 樣本結(jié)果測(cè)評(píng)對(duì)比分析-1,一步法 HBV PCR試劑對(duì)比情況分析： PE與一步法平行對(duì)比HBV樣本，總計(jì)286例；一步法定量下限500IU/ml，即有156個(gè)樣本報(bào)陰性或無結(jié)果，PE定量下限20IU/ml，總計(jì)64個(gè)樣本不報(bào)結(jié)

18、果。實(shí)際有92個(gè)弱陽性標(biāo)本被漏報(bào)，占總檢測(cè)數(shù)量的32.17%，風(fēng)險(xiǎn)相當(dāng)大；,,國(guó)產(chǎn)：曲線平臺(tái)期不明顯，擴(kuò)增效率低 重復(fù)性一般。,PE：曲線呈典型S曲線，擴(kuò)增效率高 重復(fù)性非常好,一步法 HBV PCR試劑對(duì)比情況分析：兩例樣本結(jié)果兩種試劑差異較大，復(fù)測(cè)；一步法HBV試劑檢測(cè)準(zhǔn)確性差，因雜質(zhì)未去除，試劑抗干擾能力差，重復(fù)性差，不穩(wěn)定。PE HBV 高敏試劑抗干擾能力強(qiáng)，穩(wěn)定，重復(fù)性好。,與

19、一步法 HBV PCR試劑 樣本結(jié)果測(cè)評(píng)對(duì)比分析-2,超靈敏的PCR（即高效率）需要的各種條件較高:,{(1+x)n=AF ，109 PCR產(chǎn)物分子},高靈敏的關(guān)鍵要素,PerkinElmer 全自動(dòng)核酸檢測(cè)反應(yīng)體系構(gòu)建系統(tǒng)-Pre-NAT,儀器型號(hào)：Pre-NAT條碼掃描：原始管上機(jī)，條碼掃描讀取儀器大?。?300mm x 810mm x 950mm樣本通量：1~96個(gè)樣本處理體積： 最大1.2ml液體加樣范圍：5u

20、l~800ul處理時(shí)間：2小時(shí)完成96個(gè)樣本的PCR體系構(gòu)建加樣器：4通道磁場(chǎng)控制：電磁鐵提取方法：磁珠法---轉(zhuǎn)移磁珠,,,,,,,Pre-NAT 工作流程,Pre-NAT 工作站核酸提取、擴(kuò)增前PCR反應(yīng)體系構(gòu)建等過程無需人工操作將您從繁瑣的操作中解放出來,,Walk away,Pre-NAT 四大模塊,Pre-NAT 操作界面,客戶操作流程--全自動(dòng)核酸提取工作站,啟動(dòng)客戶端軟件,點(diǎn)擊開始按鈕運(yùn)行儀器,Pre-NAT完

21、成試劑分裝、樣本提取、PCR反應(yīng)液準(zhǔn)備,根據(jù)軟件提示完成1. 選擇所需程序2. 擺放所需耗材及試劑3. 掃碼工作,PCR擴(kuò)增,,約 5~10 min,約120min,約90min,人工操作,Walk away,Accusense（精確液面感應(yīng)）技術(shù),可以感應(yīng)電離液和非電離液（如DMSO/甲醇等）?？梢栽O(shè)置高，中，低等感應(yīng)靈敏度?？商綔y(cè)的最小體積試管中100µL微孔板中50µL,每個(gè)通道取樣頭均具有液面感

22、應(yīng)功能，可獨(dú)立探測(cè)液面并在Z軸方向獨(dú)立運(yùn)動(dòng)，保證可同時(shí)操作具不同液面高度的離心管，減少一次性吸頭外壁的吸附，精確移液。,Pre-NAT技術(shù)特點(diǎn)-2,JANUS? 4道移液臂（Varispan Arm）：Varispan（移液頭間距調(diào)整）技術(shù),自動(dòng)調(diào)節(jié)Tip頭間的間距： 9 -20 mm (4 通道) 9 -40 mm (8 通道),Pre-NAT其他技術(shù)特點(diǎn),Pre-NAT其他技術(shù)特點(diǎn),模塊化設(shè)計(jì),模

23、塊化設(shè)計(jì)，通過智能計(jì)算模塊位置精準(zhǔn)定位。儀器內(nèi)部配件、載架均可移到外部進(jìn)行沖洗。從而更有效的做到防止交叉污染。,安全門設(shè)計(jì),儀器門意外打開，或按緊急制動(dòng)按鈕時(shí)，自動(dòng)暫停程序，排除意外后程序繼續(xù)進(jìn)行，不會(huì)造成整批樣本報(bào)廢的情況。,Our mission…,,,,,,,We are taking action to improve the health and safety of people and the environment.為