小反芻獸疫抗體及抗原診斷方法的初步建立.pdf

1、小反芻獸疫（PPR）是由小反芻獸疫病毒（PPRV）引起的一種急性、烈性、具有高度傳染性的疾病，主要感染山羊和綿羊。該病自1942年在非洲報道以來，迅速蔓延至全球的大多數(shù)國家，而我國2007年也首次爆發(fā)了PPR疫情，至今全國也已有二十多個省份頻繁發(fā)生PPR疫情。目前，針對PPR尚無有效的治療方法，仍然主要依靠疫苗來預防該疾病，因此建立快速的PPR抗原及抗體診斷方法對于疫情的診斷與抗體篩查具有重要意義。本論文主要完成了兩種診斷方法的初步建立

2、及應用探索：
　?。?）利用原核表達系統(tǒng)，成功表達PPRV-H蛋白和PPRV-N蛋白。獲取相應的目的基因，連接原核表達載體pET-30a，構(gòu)建重組表達質(zhì)粒pET-30a-H和pET-30a-N，轉(zhuǎn)化至E.coli BL21(DE3)表達感受態(tài)細胞中，經(jīng)IPTG誘導表達，SDS-PAGE分析表明兩種重組蛋白均以包涵體形式表達。在純化過程中由于PPRV-H重組蛋白吸附鎳柱失敗，最終選擇SDS-PAGE切膠回收純化。PPRV-N蛋白能夠

3、成功使用鎳柱純化，咪唑使用濃度為300mM。純化后的重組蛋白分別進行Western blot分析鑒定，結(jié)果表明，表達的PPRV-H蛋白和PPRV-N蛋白均具有良好的反應原性。
　　利用純化后的PPRV-H蛋白包被ELISA酶標板，分別對抗原包被濃度、血清稀釋濃度、酶標二抗稀釋濃度、抗原抗體反應時間、酶標二抗反應時間進行了優(yōu)化。做批內(nèi)及批間重復試驗結(jié)果變異系數(shù)均小于10％，說明該方法具有較好的可重復性。檢測羊口瘡、羊痘、藍舌病和山羊

4、支原體血清結(jié)果均為陰性，說明該方法具有良好的特異性。檢測臨床血清樣品80份，并與國外c-ELISA試劑盒（英國 Pirbright實驗室研制）比較，符合率為93.75%。因此，本方法可以用于小反芻獸疫的臨床血清抗體檢測及流行病學調(diào)查。
　　（2）利用純化后的PPRV-H蛋白和PPRV-N蛋白分別免疫兔子、PPRV活疫苗免疫綿羊獲得相應的高免血清。利用G蛋白親和層析柱純化血清IgG,標記納米磁珠，制備相應的免疫磁珠，結(jié)合RT-PCR