小反芻獸疫核酸疫苗的初步研究.pdf

1、小反芻獸疫是一種急性、烈性、接觸性傳染病，可感染山羊、綿羊、小鹿瞪羚及長角羚等，發(fā)病率和致死率均非常高，為重大跨國傳播的動物疫病，被世界動物衛(wèi)生組織(OIE)列為法定報告的動物疫病。該病的病原為副黏病毒科(Paramyxoviridae)麻疹病毒屬(Morbillivirus)的小反芻獸疫病毒(Peste des petits ruminants virus，PPRV)，其基因組為單股負(fù)鏈無節(jié)段RNA，有六種結(jié)構(gòu)蛋白，分別由六個基因編碼

2、，從病毒核酸的3’至5’端依次排列為N-P-M-F-H-L。該病毒只有1個血清型，但根據(jù)病毒基因組序列差異可將PPRV分為4群，其中3個群源于非洲，1個群源于亞洲。目前，在小反芻獸疫流行的國家，用小反芻獸疫弱毒疫苗接種是控制該病的主要手段。弱毒疫苗具有制備容易，可以大規(guī)模生產(chǎn)，保護(hù)率較高等優(yōu)點(diǎn)，但弱毒株具有毒力返強(qiáng)的可能性而存在安全方面的隱患。因此，研制安全高效的新型小反芻獸疫疫苗，為我國防制小反芻獸疫做好技術(shù)和物質(zhì)儲備是當(dāng)務(wù)之急。

3、 本研究根據(jù)GenBank中登錄的PPRV Nigeria75/1基因序列設(shè)計引物，利用RT-PCR技術(shù)從PPRV Nigeria75/1毒株病毒總RNA分別擴(kuò)增其H和F基因，連接到pGEM-T Easy載體并進(jìn)行序列測定。結(jié)果表明獲得的F、H基因核苷酸序列分別為1641和1830bp，與GenBank中對應(yīng)基因的同源性為達(dá)99％以上。另外分別設(shè)計引物以重組質(zhì)粒pGEM-F、pGEM-H為模板進(jìn)行PCR擴(kuò)增，獲得F、H基因的胞外區(qū)F

4、M和HM，然后利用PCR的方法將F、H基因的胞外區(qū)連接。連接產(chǎn)物克隆到pGEM-T Easy質(zhì)粒并測序鑒定。將pGEM-F、pGEM-H、pGEM-HM+FM質(zhì)粒分別進(jìn)行酶切，回收目的片段，與同樣酶切的pEGFP-N1載體連接，構(gòu)建重組真核表達(dá)載體pEGFP-F、pEGFP-H、pGEM-HM+FM。將這三種重組真核表達(dá)載體轉(zhuǎn)染BHK-21細(xì)胞，用間接熒光抗體方法檢測F、H、HM+FM蛋白的表達(dá)情況。熒光顯微鏡鏡檢結(jié)果顯示，三種重組質(zhì)粒

5、轉(zhuǎn)染后細(xì)胞內(nèi)有強(qiáng)熒光信號，陰性對照細(xì)胞和pEGFP-N1空載體轉(zhuǎn)染細(xì)胞內(nèi)未觀察到特異性熒光，說明F、H、HM+FM三種蛋白在細(xì)胞內(nèi)成功表達(dá)。提取pEGFP-F、pEGFP-H、pEGFP-HM+FM重組質(zhì)粒，按200μg/只的劑量經(jīng)肌肉注射免疫健康山羊，同時設(shè)空白和弱毒疫苗免疫對照組，在免疫后不同時間采血進(jìn)行抗體測定。結(jié)果表明pEGFP-F、pEGFP-H及pEGFP-HM+FM免疫組的山羊血清抗體在免疫后第4周達(dá)到最高峰值，之后逐漸下