新城疫（ND）核酸菌蛻疫苗的構(gòu)建及免疫效果評價(jià).pdf

1、新城疫 (Newcastle Disease，ND) 是由新城疫病毒 (Newcastle disease virus，NDV) 所致的一種高度接觸性的傳染病，能引起雞、火雞、鴨、鴿子和鸚鵡等多種禽類的感染和死亡，給世界養(yǎng)禽業(yè)造成巨大損失，因此國際獸疫局將其定為I類傳染病。目前，對該病的防制仍以疫苗免疫為主。核酸疫苗以其無致病性、研制簡單、不受母源抗體干擾等諸多優(yōu)點(diǎn)成為現(xiàn)代疫苗的研究熱點(diǎn)，但研究也發(fā)現(xiàn)核酸疫苗存在著免疫方式有限、免疫原性

2、不強(qiáng)，常需高劑量多次免疫等問題。因而，人們開始轉(zhuǎn)向?qū)怂嵋呙缱魟┖洼d體的研究，希望能夠通過各種佐劑、載體的使用來揚(yáng)長補(bǔ)短，使其免疫效果得到進(jìn)一步提高。菌蛻是通過生物分子裂解制備而成，由于Gˉ菌具有完整的生物親和性的外膜結(jié)構(gòu)，如菌毛能夠進(jìn)行特異的細(xì)胞和組織定位，其表面的脂多糖成分可以作為一種天然佐劑，而且菌蛻的胞周間隙和細(xì)胞空腔可接收大量外源物質(zhì)，菌蛻因而成為一種新型無病原性的生物載體和靶向工具。本課題以此為著眼點(diǎn)，以分子裂解方法制備的菌

3、蛻作為載體，與構(gòu)建表達(dá)NDV F基因的核酸疫苗制備成新城疫核酸菌蛻疫苗，并進(jìn)行實(shí)驗(yàn)動物(雞)的免疫試驗(yàn)。主要研究內(nèi)容如下： 1．表達(dá)新城疫F基因核酸疫苗的構(gòu)建根據(jù)GeneBank中公布的Lasota株F基因的核苷酸序列(AF077761)設(shè)計(jì)引物，并分別在上下游引入BamH Ⅰ和Kpn Ⅰ限制性內(nèi)切酶位點(diǎn)，以利于插入真核表達(dá)載體pcDNA3.1+。以新城疫Lasota弱毒株為研究材料，提取出基因組RNA并以其為模板，通過RT-P

4、CR技術(shù)擴(kuò)增新城疫病毒F基因完整片斷，擴(kuò)增產(chǎn)物經(jīng)純化回收后與pMD18-T載體相連，轉(zhuǎn)化DH5a感受態(tài)細(xì)胞，經(jīng)PCR和酶切電泳鑒定，均得到了大小約1700bp左右的條帶，證實(shí)擴(kuò)增產(chǎn)物已插入T載體。獲得的重組質(zhì)粒pT-F經(jīng)雙酶切將F基因插入到pcDNA3.1+載體中，PCR和酶切鑒定顯示表達(dá)新城疫F基因的核酸疫苗pcDNA3-F構(gòu)建成功。 2．大腸桿菌DH5a菌蛻的制備菌蛻是由裂解蛋白E介導(dǎo)的Gˉ菌的裂解而產(chǎn)生，編碼有噬菌體Phi

5、X174基因E的裂解質(zhì)粒，可在溫敏阻遏元件cI857的控制下進(jìn)行E基因的限制性表達(dá)。在溫度低于30℃時(shí)，阻遏蛋白c1857的表達(dá)使基因E能被很好地抑制，溫度高于30℃時(shí)，因阻遏蛋白cI857的熱失活而使基因E開始表達(dá)，在42℃時(shí)細(xì)菌的裂解達(dá)到最佳狀態(tài)。將含有裂解質(zhì)粒(pHH43)的大腸桿菌DH5a于28℃ 200rpm搖床培養(yǎng)，為獲得最大量的菌蛻，當(dāng)OD<,600>=0.4～0.6時(shí)，迅速升高溫度至42℃以啟動E裂解蛋白的表達(dá)并開始計(jì)時(shí)

6、，4小時(shí)后收集菌蛻。菌落計(jì)數(shù)(CFU)結(jié)果表明有99.998％的細(xì)菌被有效裂解。掃描電鏡觀察可見裂解孔道位于細(xì)菌一端或中間，而胞內(nèi)的物質(zhì)已經(jīng)排出，菌蛻保留了較完整的外膜，細(xì)菌形態(tài)沒有發(fā)生太大改變。 3．新城疫核酸菌蛻疫苗的制備將菌蛻重懸于含有質(zhì)粒pcDNA3-F的PBS(pH7.4)體系中，加入終濃度25mM CaCl<,2>溶液，隨后在不同條件下，150rpm搖床孵育。為確定質(zhì)粒DNA的最佳構(gòu)建濃度，將菌蛻與不同濃度的質(zhì)粒DN

7、A(5～14mg/ml)孵育，37℃ 30min后離心收集沉淀和上清；為確定最佳構(gòu)建溫度，將菌蛻與pcDNA3-F(10mg/ml)在不同的溫度下進(jìn)行孵育(4℃、25℃、37℃)，30min后離心收集沉淀和上清；為確定孵育時(shí)間，將菌蛻與pcDNA3-F(10mg/ml)，于25℃進(jìn)行孵育，分別在2min、4min、10min、30min、60min、120min、180min時(shí)，離心收集沉淀和上清。所有離心均為8000rpm 10min

8、，收集的上清通過測定OD<,260/280>以確定DNA的量。通過改變DNA的濃度、孵育溫度和孵育時(shí)間發(fā)現(xiàn)，裝載前DNA的濃度與菌蛻中DNA的量成正相關(guān)，孵育溫度與裝載效果沒有明顯關(guān)聯(lián)，孵育時(shí)間2min足夠。 4．新城疫核酸菌蛻疫苗免疫效果的評定將7日齡健康雛雞隨機(jī)分為7組，每組30只，分別為PBS對照組(Ⅰ組)，pcDNA3.1+對照組(Ⅱ組)，裸DNA疫苗(pcDNA3-F)組(Ⅲ組)，Lasota弱毒疫苗組(Ⅳ組)，新城疫核酸菌蛻

9、苗滴鼻組(Ⅴ組)，新城疫核酸菌蛻苗口服組(Ⅵ組)，新城疫核酸菌蛻苗肌注組(Ⅶ組)。兩周后每組各以相同的劑量和途徑進(jìn)行加強(qiáng)免疫一次，二免后第2周用新城疫強(qiáng)毒分離株進(jìn)行攻毒。通過間接ELISA、血凝抑制抗體檢測及攻毒保護(hù)試驗(yàn)，對新城疫核酸疫苗的免疫效價(jià)進(jìn)行初步的評定。間接ELISA試驗(yàn)結(jié)果表明：首免后一周，與PBS和pcDNA3.1+對照組相比，pcDNA3-F組、Lasota弱毒疫苗組和新城疫核酸菌蛻疫苗組OD值已有所升高，說明所構(gòu)建的核

10、酸疫苗已在雛雞體中進(jìn)行了表達(dá)，表達(dá)產(chǎn)物作為抗原刺激機(jī)體產(chǎn)生了免疫應(yīng)答反應(yīng)；首免后兩周，除對照組外的所有免疫組的OD值均有顯著的升高，并且與對照組相比，差異極顯著(P<0.01)；二免后一周，核酸菌蛻疫苗滴鼻組OD值顯著(P<0.05)高于裸DNA疫苗組，二免后兩周達(dá)到極顯著(P<0.01)，盡管最終沒有達(dá)到Lasota疫苗組所產(chǎn)生的抗體水平。在同一時(shí)期的所有試驗(yàn)組血清抗體OD值中，Lasota疫苗組始終保持最高水平，而空白組和空載體組的