人參莖葉皂甙提高口蹄疫和新城疫油佐劑疫苗免疫效果的研究.pdf

1、疫苗是畜牧生產(chǎn)中控制動物傳染病的重要工具，但在臨床實際中存在疫苗免疫失敗和油佐劑疫苗注射困難等現(xiàn)象。我們前期的研究表明，GSLS和油佐劑有協(xié)同作用，能提高疫苗的免疫效果，本論文在此基礎(chǔ)上，進(jìn)一步研究GSLS和油佐劑協(xié)同作用增強疫苗免疫效果的合適比例，觀察GSLS與油佐劑組合增強豬FMD疫苗和雞ND疫苗的免疫效果，并對油佐劑疫苗添加GSLS后的黏滯度進(jìn)行了觀察。研究結(jié)果可為應(yīng)用GSLS改進(jìn)動物疫苗提供參考。
　　 1.FMD疫苗中

2、添加不同劑量GSLS對小鼠免疫反應(yīng)的影響
　　 目的:觀察GSLS對小鼠注射FMD油佐劑疫苗免疫佐劑作用，篩選GSLS對FMD油乳劑疫苗免疫佐劑作用的合適濃度。方法:將56只雌性ICR小鼠隨機分為7組，組1小鼠皮下注射0.1 ml的FMDV抗原+0.1 ml生理鹽水，組2-7每組小鼠腹部皮下分別注射含不同濃度GSLS（0、2、4、6、8和10μg/0.2 ml）的FMD油乳劑疫苗，小鼠免疫2次，間隔3周。二免后2周采血，用雙抗夾

3、心ELISA方法檢測血清中FMDV特異性IgG水平.結(jié)果:疫苗中添加4、6、8和10μg的GSLS能顯著提高小鼠血清中FMDV特異性IgG水平(P＜0.05），其中以4μg組的FMDV特異性IgG水平最高。結(jié)論:FMD油乳劑疫苗中添加GSLS可顯著提高小鼠的FMDV特異性IgG水平，提高的幅度呈劑量依賴關(guān)系，以4μg組的幅度最高。
　　 2.GSLS對低劑量抗原FMD油乳劑疫苗免疫效果的影響
　　 目的:比較FMD全抗原

4、劑量油乳劑疫苗和含GSLS的低劑量抗原油乳劑疫苗對小鼠的免疫效果。方法:將72只ICR小鼠隨機分成9組，每組8只小鼠。各組動物皮下注射的實驗疫苗組成如下:(1)100μl的FMDV抗原+100μl生理鹽水;(2)100μl抗原+100μl油佐劑Oil＃10;(3)100μl抗原+100μl油佐劑MC52;(4)～(6)100μl，50μl或25μl抗原+100μl油佐劑Oil＃10+GSLS(4μg);(7)～(9)100μl，50μl

5、或25μl抗原+100μl油佐劑MC52+GSLS(4μg)。免疫2次，間隔3周，每次注射的體積為200μl。二免后2周采血，并取脾臟制備脾臟淋巴細(xì)胞懸液。用雙抗夾心ELISA檢測血清中FMDV特異性IgG水平，用MTT法檢測經(jīng)ConA、LPS和FMDV刺激后的淋巴細(xì)胞增殖指數(shù)，并用RT-PCR方法檢測脾臟淋巴細(xì)胞經(jīng)FMDV刺激后的IFN-γ和IL-4以及轉(zhuǎn)錄因子T-bet和GATA-3中mRNA表達(dá)水平。結(jié)果:含GSLS的油佐劑疫苗誘

6、導(dǎo)的特異性IgG效價顯著高于不合GSLS的油佐劑疫苗(P＜0.05）;含GSLS的半劑量抗原的油乳劑疫苗誘導(dǎo)的血清特異性IgG效價高于不含GSLS的全劑量抗原油乳劑疫苗，但無統(tǒng)計學(xué)差異顯著(P＞0.05）;含GSLS的四分之一劑量抗原的油乳劑疫苗誘導(dǎo)的血清特異性IgG效價低于不合GSLS的全劑量抗原油乳劑疫苗，但無統(tǒng)計學(xué)差異(P＞0.05)。此外，油乳劑疫苗中添加GSLS后，增強了小鼠脾臟淋巴細(xì)胞受Con A、LPS和FMDV刺激產(chǎn)生增

7、殖能力(P＜0.05)，提高脾臟淋巴細(xì)胞受FMDV刺激后IFN-γ、IL-4、T-bet和GATA-3的mRNA表達(dá)水平(P＜0.05）。結(jié)論:油佐劑疫苗中添加GSLS能顯著增強小鼠的體液和細(xì)胞免疫應(yīng)答，使僅含一半抗原劑量疫苗誘導(dǎo)的IgG水平到含全劑量抗原誘導(dǎo)的IgG水平。
　　 3.FMD油佐劑疫苗中添加不同劑量GSLS對豬的免疫效果
　　 目的:觀察FMD油佐劑疫苗添加GSLS對豬的免疫效果。方法:試驗一:將48只豬

8、隨機分成6組，每頭豬頸部分別皮下注射含GSLS為0μg、10μg、20μg、40μg、80μg和160μg的FMD疫苗，免疫2次，間隔3周，每次注射疫苗劑量2 ml。在免疫前，免疫后第3、6周前腔靜脈采血，用正向間接血凝法檢測血清中IHA水平，并分離淋巴細(xì)胞，用MTT法檢測淋巴細(xì)胞增殖。試驗二:將24頭豬隨機分成4組，每頭豬頸部皮下分別注射含不同佐劑FMD疫苗(Oil＃10，MC52，Oil＃10+40μg GSLS，MC52+40μg

9、 GSLS)，免疫1次，注射體積為2 ml。于免疫前，免疫后第3、6周前腔靜脈采血，檢測血清中IHA效價，IgG和IgG亞類水平。結(jié)果:試驗一:免疫后3、6周，每個劑量的FMD疫苗中添加40μgGSLS能顯著提高豬特異性IHA效價(P＜0.05），外周血淋巴細(xì)胞受FMDV刺激后產(chǎn)生的增殖能力顯著升高(P＜0.05），而受Con A刺激后產(chǎn)生的淋巴細(xì)胞增殖能力高于對照組，但無統(tǒng)計學(xué)差異(P＞0.05）。試驗二:與不添加GSLS的對照組相比

10、，添加GSLS的油佐劑疫苗組在免疫后3周，IHA效價升高不顯著(P＞0.05），IgG、IgGl和IgG2水平顯著升高（P＜0.05）;免疫后6周，血清中IHA效價顯著升高(P＜0.05)，IgG、IgG1和IgG2水平均顯著上升(P＜0.05）。結(jié)論:每個劑量FMD油佐劑疫苗中添加40μg GSLS能顯著增強豬的體液免疫和細(xì)胞免疫.
　　 4.不同劑量GSLS對雞新城疫油佐劑疫苗免疫的影響
　　 目的:觀察雞ND疫苗中

11、添加GSLS對雞免疫反應(yīng)的影響。方法:將60只1日齡梅嶺土雞分成5組，每組12只，12日齡時，在每只雞的胸大肌內(nèi)分別注射含不同劑量的GSLS（0、2、4、6和8μg）雞ND油佐劑疫苗，免疫為0.2 ml。于免疫前，免疫后1、2和3周經(jīng)心臟采血收集血樣，用血凝抑制試驗測定血清HI效價，3周后摘取雞脾臟，制備脾臟淋巴細(xì)胞懸液，采用MTT法檢測脾臟淋巴細(xì)胞增殖。結(jié)果:每劑量疫苗中添加6μg的GSLS，血清HI效價在免疫后1周升高不顯著，在免疫

12、后第2周和第3周，顯著升高(P＜0.05）;免疫后3周，脾臟淋巴細(xì)胞對LPS和NDV刺激的增殖反應(yīng)顯著高于對照組(P＜0.05)，各組脾臟淋巴細(xì)胞對ConA刺激的增殖反應(yīng)之間沒有明顯差異(P＞0.05); ND疫苗中添加GSLS對雞的體重不產(chǎn)生顯著差異(P＞0.05）;各組雞的疫苗注射部位沒有發(fā)現(xiàn)明顯的局部副作用。結(jié)論:ND疫苗中添加GSLS能顯著增強雞的體液免疫和細(xì)胞免疫應(yīng)答水平，并對免疫雞不產(chǎn)生可見的副作用。
　　 5.油佐

13、劑疫苗中添加GSLS對疫苗黏滯性的影響
　　 目的:觀察油佐劑疫苗中添加GSLS對疫苗黏滯性的影響。方法:將GSLS(30g)溶解在60 ml二甲基亞砜中，制備361 mg/ml的GSLS儲存液(83 ml)，根據(jù)用量將GSLS儲存液添加在MC52白油中并攪拌均勻，然后與FMDV抗原混合，采用均質(zhì)乳化機制備分別制備油相/水相比為1比1（或2比1），吐溫濃度分別為0.5％、1.0％、1.5％、2.0％、2.5％和3.0％的油包水型

14、FMD油乳劑疫苗，采用玻璃粘度計測定各組疫苗的黏滯性。結(jié)果:當(dāng)吐溫濃度為1.0％和1.5％時，添加4μg劑量GSLS油佐劑疫苗（1比1）流動時間顯著短于對照組（P＜0.05）;當(dāng)吐溫濃度為為1.5％和2.0％時，添加4μg/劑量GSLS能顯著降低油佐劑疫苗(2比1)流動時間(P＜0.05)。結(jié)論:油乳劑疫苗中添加GSLS能降低疫苗的黏滯性。
　　 綜上所述，F(xiàn)MD油乳劑疫苗中添加GSLS可顯著提高小鼠血清特異性IgG水平，提高的

15、幅度呈劑量依賴關(guān)系，以4μg組的幅度最高;FMD油佐劑疫苗中添加GSLS能顯著增強小鼠血清FMDV特異性IgG水平和淋巴細(xì)胞增殖轉(zhuǎn)化指數(shù)，增強使僅含一半抗原劑量疫苗誘導(dǎo)的IgG水平到含全劑量抗原誘導(dǎo)的IgG水平，說明GSLS增強小鼠對低劑量抗原疫苗的免疫應(yīng)答;FMD疫苗中添加40μg的GSLS能顯著增強豬血清IHA，IgG和IgG亞類水平，增強淋巴細(xì)胞增殖指數(shù)，表明GSLS對豬FMD疫苗具有較好的免疫佐劑作用;ND疫苗中添加6μgGSL

16、S能顯著增強雞血清HI效價和淋巴細(xì)胞增殖轉(zhuǎn)化指數(shù)，并且沒有對免疫雞產(chǎn)生明顯可見的副作用，說明GSLS能通過增強雞的體液免疫應(yīng)答和細(xì)胞免疫應(yīng)答來發(fā)揮免疫佐劑作用;當(dāng)吐溫濃度為1.0％和1.5％時，添加4μg劑量GSLS油佐劑疫苗（油/水=1∶1）流動時間顯著短于對照組(P＜0.05）;當(dāng)吐溫濃度為為1.5％和2.0％時，添加4μg/劑量GSLS能顯著降低油佐劑疫苗（油/水=2∶1）流動時間(P＜0.05），說明油乳劑疫苗中添加GSLS能降