口服黃芪多糖和人參莖葉皂苷增強(qiáng)口蹄疫疫苗及腸道黏膜免疫的研究.pdf

1、疫苗免疫是養(yǎng)殖業(yè)控制動(dòng)物疫病的主要措施之一。但現(xiàn)代畜牧業(yè)由于集約化飼養(yǎng)以及應(yīng)激等因素可導(dǎo)致動(dòng)物免疫功能下降，從而使動(dòng)物對(duì)疫苗免疫的應(yīng)答能力降低，引起免疫失敗。補(bǔ)氣類中藥具有提高動(dòng)物免疫機(jī)能的作用。人參和黃芪是重要的補(bǔ)氣中藥，多糖和皂苷是補(bǔ)氣類中藥的重要化學(xué)部位，本文以小鼠為實(shí)驗(yàn)動(dòng)物，研究口服黃芪多糖、人參莖葉皂苷對(duì)口蹄疫(foot-and-mouth diseases，F(xiàn)MD)疫苗免疫的影響。由于大多數(shù)中藥的給藥途徑是口服，給藥后藥物直

2、接作用于消化道，近年來(lái)研究發(fā)現(xiàn)，腸道黏膜免疫系統(tǒng)對(duì)于維持機(jī)體消化器官完整性和發(fā)揮局部免疫調(diào)節(jié)作用都至關(guān)重要，因此，口服黃芪多糖、人參莖葉皂苷對(duì)腸道黏膜免疫的影響也是本研究的重點(diǎn)。研究結(jié)果可為采用中藥多糖和皂苷提高動(dòng)物免疫機(jī)能提供依據(jù)，并為探討它們的免疫增強(qiáng)作用機(jī)理提供參考。
　　1.口服黃芪多糖對(duì)口蹄疫疫苗免疫的影響
　　為了探究口服黃芪多糖對(duì)口蹄疫疫苗免疫效果的影響，將24只小鼠按體重隨機(jī)分為4組，每組6只。第1組為生理鹽

3、水對(duì)照，第2～4組每只小鼠每天口服含25mg、50mg、100mg黃芪多糖的水溶液，連續(xù)4天。最后一次給藥后24h，每只小鼠在腹股溝部皮下注射FMD疫苗（OS/99+OZK/93株）0.2mL，2周后加強(qiáng)免疫一次。二免后1-5周采集血液分離血清，用間接ELISA法檢測(cè)FMD特異性IgG及其亞類。結(jié)果表明:二免后3周，與對(duì)照組相比口服25mg黃芪多糖可顯著提高小鼠血清FMD特異性IgG、IgG亞類水平(P＜0.05)，說明口服黃芪多糖對(duì)F

4、MD疫苗免疫具有增強(qiáng)作用。
　　2.口服黃芪多糖對(duì)脾淋巴細(xì)胞增殖及腸道黏膜免疫的影響
　　為了探究口服黃芪多糖(astragalus polysaccharides，APS)對(duì)脾臟淋巴細(xì)胞增殖及腸道黏膜免疫的影響，將40只小鼠隨機(jī)分為2組，每組20只。實(shí)驗(yàn)組每只小鼠口服含25mg黃芪多糖水溶液，連續(xù)4天，對(duì)照組口服生理鹽水為對(duì)照。用藥后第0、1、2、3周，每組處死5只小鼠，收集脾臟制備脾淋巴細(xì)胞懸液進(jìn)行脾淋巴細(xì)胞增殖實(shí)驗(yàn)（M

5、TT法）;采集十二指腸組織，采用免疫組化方法檢測(cè)腸黏膜上皮內(nèi)淋巴細(xì)胞和固有層IgA+細(xì)胞。結(jié)果顯示:口服黃芪多糖后1、2周，小鼠脾淋巴細(xì)胞對(duì)刀豆蛋白A(conconavalin A，ConA)和脂多糖(lipopolysaccharide，LPS)刺激引起的增殖反應(yīng)顯著高于對(duì)照組(P＜0.05);口服黃芪多糖后0、1、2周，小鼠十二指腸黏膜上皮內(nèi)淋巴細(xì)胞及固有層IgA+細(xì)胞數(shù)顯著高于對(duì)照組(P＜0.05)，說明口服黃芪多糖能夠促進(jìn)機(jī)體的

6、細(xì)胞免疫反應(yīng)和腸道黏膜免疫反應(yīng)。
　　3.口服人參莖葉皂苷對(duì)口蹄疫疫苗免疫的影響
　　為了探究人參莖葉皂苷對(duì)口蹄疫疫苗免疫的影響，將24只小鼠根據(jù)體重隨機(jī)分為4組，每組6只。第1組口服生理鹽水為對(duì)照，第2～4組每只小鼠每天口服含0.05mg、0.5mg、5mg人參莖葉皂苷的水溶液，連續(xù)4天。最后一次給藥后24h，每只小鼠在腹股溝部皮下注射FMD疫苗（OS/99+OZK/93株）0.2mL，2周后加強(qiáng)免疫一次。二免后5周內(nèi)每周

7、采血，分離血清，間接ELISA法檢測(cè)FMD特異性IgG及其亞類。結(jié)果表明:二免后3周，與對(duì)照組相比口服0.5mg人參莖葉皂苷可顯著提高小鼠血清口蹄疫特異性IgG、IgG亞類水平(P＜0.05)，說明口服人參莖葉皂苷能夠顯著提高小鼠對(duì)口蹄疫疫苗的免疫反應(yīng)。
　　4.口服人參莖葉皂苷對(duì)脾淋巴細(xì)胞增殖及腸道黏膜免疫的影響
　　為了探究口服人參莖葉皂苷對(duì)脾臟淋巴細(xì)胞增殖及腸道黏膜免疫的影響，將40只小鼠隨機(jī)分為2組，每組20只。實(shí)驗(yàn)

8、組小鼠口服含0.5mg人參莖葉皂苷的水溶液，連續(xù)4天，對(duì)照組口服生理鹽水。用藥后第0、1、2、3周，每組處死5只小鼠，收集脾臟，制備脾淋巴細(xì)胞懸浮液，用于脾淋巴細(xì)胞增殖實(shí)驗(yàn)（MTT法）;同時(shí)采集十二指腸腸段，采用免疫組化方法檢測(cè)腸粘膜上皮內(nèi)淋巴細(xì)胞和固有層IgA+細(xì)胞。實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明口服0.5mg人參莖葉皂苷后1、2周，小鼠脾臟淋巴細(xì)胞對(duì)Con A和LPS刺激引起的增殖反應(yīng)顯著高于對(duì)照組(P＜0.05);給藥后0、1、2周，小鼠十二指腸黏

9、膜上皮內(nèi)淋巴細(xì)胞及固有層IgA+細(xì)胞數(shù)顯著高于對(duì)照組(P＜0.05)，說明口服人參莖葉皂苷能夠促進(jìn)機(jī)體脾臟細(xì)胞的增殖功能，增強(qiáng)機(jī)體的細(xì)胞免疫和體液免疫應(yīng)答，同時(shí)也能增強(qiáng)腸道黏膜免疫。
　　5.黃芪多糖和人參莖葉皂苷免疫增強(qiáng)作用的比較研究
　　為了比較口服黃芪多糖和人參莖葉皂苷對(duì)口蹄疫疫苗免疫的增強(qiáng)作用，將24只小鼠根據(jù)體重隨機(jī)分為4組，每組6只。第1-3組每只小鼠分別口服生理鹽水、含25mg黃芪多糖的水溶液、含0.5mg人參

10、莖葉皂苷的水溶液，連用4天。給藥后24小時(shí)，第1～3組小鼠每只腹股溝皮下注射O型FMD滅活疫苗(O/My98/XJ/2010株+O/GX/09-7株)200μL，間隔2周后加強(qiáng)免疫一次。第4組不免疫作陰性對(duì)照。各組小鼠于二免后1、2、3周采集血液，檢測(cè)血清特異性IgG、IgG滴度及IFN-γ水平。此外，二免后3周處死小鼠，采集十二指腸黏膜組織，采用RT-PCR方法檢測(cè)腸道黏膜相關(guān)免疫基因mRNA表達(dá)。結(jié)果表明，口服黃芪多糖和人參莖葉皂苷

11、能顯著提升血清特異性IgG及IgG滴度水平，上調(diào)腸道黏膜組織趨化因子(CCL25、CCL28)、趨化因子受體(CCR9、CCR10)、CD80、CD86、MHC-Ⅱ、TLR4及NF-κB p65mRNA表達(dá)水平，提示口服黃芪多糖和人參莖葉皂苷通過上調(diào)腸黏膜相關(guān)免疫基因mRNA表達(dá)，促進(jìn)腸道上皮內(nèi)淋巴細(xì)胞(IELs)和固有層IgA分泌型漿細(xì)胞歸巢至腸黏膜上皮及固有層，同時(shí)能夠促進(jìn)腸黏膜樹突狀細(xì)胞的成熟，增強(qiáng)機(jī)體對(duì)抗原的遞呈能力和刺激腸黏膜

12、免疫細(xì)胞（主要是T、B細(xì)胞）活化，從而增強(qiáng)腸道黏膜免疫及獲得性免疫應(yīng)答水平。
　　本研究結(jié)果表明口服黃芪多糖和人參莖葉皂苷，能夠顯著提升口蹄疫疫苗免疫血清特異性IgG、IgG亞類、IgG滴度水平，促進(jìn)脾臟淋巴細(xì)胞經(jīng)刀豆蛋白A(ConA)和脂多糖(LPS)誘導(dǎo)的增殖反應(yīng)。免疫組化結(jié)果表明，口服黃芪多糖和人參莖葉皂苷顯著增加腸道黏膜上皮內(nèi)淋巴細(xì)胞(IELs)和固有層IgA分泌型漿細(xì)胞數(shù)目，從而提高腸道黏膜免疫。RT-PCR結(jié)果提示口服