口服黃芪多糖和人參莖葉皂苷增強口蹄疫疫苗及腸道黏膜免疫的研究.pdf

1、疫苗免疫是養(yǎng)殖業(yè)控制動物疫病的主要措施之一。但現(xiàn)代畜牧業(yè)由于集約化飼養(yǎng)以及應(yīng)激等因素可導(dǎo)致動物免疫功能下降，從而使動物對疫苗免疫的應(yīng)答能力降低，引起免疫失敗。補氣類中藥具有提高動物免疫機能的作用。人參和黃芪是重要的補氣中藥，多糖和皂苷是補氣類中藥的重要化學(xué)部位，本文以小鼠為實驗動物，研究口服黃芪多糖、人參莖葉皂苷對口蹄疫(foot-and-mouth diseases，F(xiàn)MD)疫苗免疫的影響。由于大多數(shù)中藥的給藥途徑是口服，給藥后藥物直

2、接作用于消化道，近年來研究發(fā)現(xiàn)，腸道黏膜免疫系統(tǒng)對于維持機體消化器官完整性和發(fā)揮局部免疫調(diào)節(jié)作用都至關(guān)重要，因此，口服黃芪多糖、人參莖葉皂苷對腸道黏膜免疫的影響也是本研究的重點。研究結(jié)果可為采用中藥多糖和皂苷提高動物免疫機能提供依據(jù)，并為探討它們的免疫增強作用機理提供參考。
　　1.口服黃芪多糖對口蹄疫疫苗免疫的影響
　　為了探究口服黃芪多糖對口蹄疫疫苗免疫效果的影響，將24只小鼠按體重隨機分為4組，每組6只。第1組為生理鹽

3、水對照，第2～4組每只小鼠每天口服含25mg、50mg、100mg黃芪多糖的水溶液，連續(xù)4天。最后一次給藥后24h，每只小鼠在腹股溝部皮下注射FMD疫苗（OS/99+OZK/93株）0.2mL，2周后加強免疫一次。二免后1-5周采集血液分離血清，用間接ELISA法檢測FMD特異性IgG及其亞類。結(jié)果表明:二免后3周，與對照組相比口服25mg黃芪多糖可顯著提高小鼠血清FMD特異性IgG、IgG亞類水平(P＜0.05)，說明口服黃芪多糖對F

4、MD疫苗免疫具有增強作用。
　　2.口服黃芪多糖對脾淋巴細胞增殖及腸道黏膜免疫的影響
　　為了探究口服黃芪多糖(astragalus polysaccharides，APS)對脾臟淋巴細胞增殖及腸道黏膜免疫的影響，將40只小鼠隨機分為2組，每組20只。實驗組每只小鼠口服含25mg黃芪多糖水溶液，連續(xù)4天，對照組口服生理鹽水為對照。用藥后第0、1、2、3周，每組處死5只小鼠，收集脾臟制備脾淋巴細胞懸液進行脾淋巴細胞增殖實驗（M

5、TT法）;采集十二指腸組織，采用免疫組化方法檢測腸黏膜上皮內(nèi)淋巴細胞和固有層IgA+細胞。結(jié)果顯示:口服黃芪多糖后1、2周，小鼠脾淋巴細胞對刀豆蛋白A(conconavalin A，ConA)和脂多糖(lipopolysaccharide，LPS)刺激引起的增殖反應(yīng)顯著高于對照組(P＜0.05);口服黃芪多糖后0、1、2周，小鼠十二指腸黏膜上皮內(nèi)淋巴細胞及固有層IgA+細胞數(shù)顯著高于對照組(P＜0.05)，說明口服黃芪多糖能夠促進機體的

6、細胞免疫反應(yīng)和腸道黏膜免疫反應(yīng)。
　　3.口服人參莖葉皂苷對口蹄疫疫苗免疫的影響
　　為了探究人參莖葉皂苷對口蹄疫疫苗免疫的影響，將24只小鼠根據(jù)體重隨機分為4組，每組6只。第1組口服生理鹽水為對照，第2～4組每只小鼠每天口服含0.05mg、0.5mg、5mg人參莖葉皂苷的水溶液，連續(xù)4天。最后一次給藥后24h，每只小鼠在腹股溝部皮下注射FMD疫苗（OS/99+OZK/93株）0.2mL，2周后加強免疫一次。二免后5周內(nèi)每周

7、采血，分離血清，間接ELISA法檢測FMD特異性IgG及其亞類。結(jié)果表明:二免后3周，與對照組相比口服0.5mg人參莖葉皂苷可顯著提高小鼠血清口蹄疫特異性IgG、IgG亞類水平(P＜0.05)，說明口服人參莖葉皂苷能夠顯著提高小鼠對口蹄疫疫苗的免疫反應(yīng)。
　　4.口服人參莖葉皂苷對脾淋巴細胞增殖及腸道黏膜免疫的影響
　　為了探究口服人參莖葉皂苷對脾臟淋巴細胞增殖及腸道黏膜免疫的影響，將40只小鼠隨機分為2組，每組20只。實驗

8、組小鼠口服含0.5mg人參莖葉皂苷的水溶液，連續(xù)4天，對照組口服生理鹽水。用藥后第0、1、2、3周，每組處死5只小鼠，收集脾臟，制備脾淋巴細胞懸浮液，用于脾淋巴細胞增殖實驗（MTT法）;同時采集十二指腸腸段，采用免疫組化方法檢測腸粘膜上皮內(nèi)淋巴細胞和固有層IgA+細胞。實驗結(jié)果表明口服0.5mg人參莖葉皂苷后1、2周，小鼠脾臟淋巴細胞對Con A和LPS刺激引起的增殖反應(yīng)顯著高于對照組(P＜0.05);給藥后0、1、2周，小鼠十二指腸黏

9、膜上皮內(nèi)淋巴細胞及固有層IgA+細胞數(shù)顯著高于對照組(P＜0.05)，說明口服人參莖葉皂苷能夠促進機體脾臟細胞的增殖功能，增強機體的細胞免疫和體液免疫應(yīng)答，同時也能增強腸道黏膜免疫。
　　5.黃芪多糖和人參莖葉皂苷免疫增強作用的比較研究
　　為了比較口服黃芪多糖和人參莖葉皂苷對口蹄疫疫苗免疫的增強作用，將24只小鼠根據(jù)體重隨機分為4組，每組6只。第1-3組每只小鼠分別口服生理鹽水、含25mg黃芪多糖的水溶液、含0.5mg人參

10、莖葉皂苷的水溶液，連用4天。給藥后24小時，第1～3組小鼠每只腹股溝皮下注射O型FMD滅活疫苗(O/My98/XJ/2010株+O/GX/09-7株)200μL，間隔2周后加強免疫一次。第4組不免疫作陰性對照。各組小鼠于二免后1、2、3周采集血液，檢測血清特異性IgG、IgG滴度及IFN-γ水平。此外，二免后3周處死小鼠，采集十二指腸黏膜組織，采用RT-PCR方法檢測腸道黏膜相關(guān)免疫基因mRNA表達。結(jié)果表明，口服黃芪多糖和人參莖葉皂苷

11、能顯著提升血清特異性IgG及IgG滴度水平，上調(diào)腸道黏膜組織趨化因子(CCL25、CCL28)、趨化因子受體(CCR9、CCR10)、CD80、CD86、MHC-Ⅱ、TLR4及NF-κB p65mRNA表達水平，提示口服黃芪多糖和人參莖葉皂苷通過上調(diào)腸黏膜相關(guān)免疫基因mRNA表達，促進腸道上皮內(nèi)淋巴細胞(IELs)和固有層IgA分泌型漿細胞歸巢至腸黏膜上皮及固有層，同時能夠促進腸黏膜樹突狀細胞的成熟，增強機體對抗原的遞呈能力和刺激腸黏膜

12、免疫細胞（主要是T、B細胞）活化，從而增強腸道黏膜免疫及獲得性免疫應(yīng)答水平。
　　本研究結(jié)果表明口服黃芪多糖和人參莖葉皂苷，能夠顯著提升口蹄疫疫苗免疫血清特異性IgG、IgG亞類、IgG滴度水平，促進脾臟淋巴細胞經(jīng)刀豆蛋白A(ConA)和脂多糖(LPS)誘導(dǎo)的增殖反應(yīng)。免疫組化結(jié)果表明，口服黃芪多糖和人參莖葉皂苷顯著增加腸道黏膜上皮內(nèi)淋巴細胞(IELs)和固有層IgA分泌型漿細胞數(shù)目，從而提高腸道黏膜免疫。RT-PCR結(jié)果提示口服