牛氣腫疽CctA基因核酸疫苗的制備及免疫效果評價.pdf

1、氣腫疽（Clostridium chauvoei）是一種由專性厭氧菌氣腫疽梭菌引起的牛、羊等急性、敗血性傳染病。常見的病理特征分別為肌群部位有炎性癥狀、氣性腫脹，觸壓時產(chǎn)生捻發(fā)音，并且具有地區(qū)流行性、季節(jié)性等特點。此病夏季多發(fā)，多見于潮濕的山谷牧場和沼澤地區(qū)。延邊朝鮮族自治州位于吉林省東側，山區(qū)叢林茂密多雨，近些年牛氣腫疽的發(fā)病率相對較高，給當?shù)氐男竽翗I(yè)和養(yǎng)殖業(yè)發(fā)展影響巨大，并且對當?shù)鼐用竦恼Ｉ钜伯a(chǎn)生了極大的威脅。
　　為了控

2、制延邊地區(qū)氣腫疽病的發(fā)病率，制備安全且有效的氣腫疽核酸疫苗是非常必要的，本試驗的建立基礎是根據(jù)NCBI上氣腫疽梭菌細胞毒素A(CctA)的基因序列設計出一對特異性引物。將PCR擴增的CctA基因通過PCR擴增后克隆到pMD19-T simple載體，分析通過正確測序的CctA基因序列，再次克隆至pcDNA3.1-1真核表達載體，并且將其轉染到Vero細胞，用來確定CctA基因是否表達的方法分別為間接免疫熒光和免疫印跡兩種方法。測定表達質(zhì)

3、粒濃度后進行小鼠免疫試驗，使用間接ELISA測定小鼠IgG1、IgG2a抗體水平，用ELISA試劑盒測定IL-4和IFN-γ細胞因子水平。
　　研究結果顯示，CctA基因通過擴增后為519 bp，同源性比對氣腫疽梭菌ATCC10092菌株和測序后得到的CctA基因核苷酸和氨基酸序列，存在3處點突變，與其他6株菌氨基酸序列比較存在2個位點突變;這些氨基酸序列的同源性為98.8％，核苷酸序列的同源性為99.4％。pcDNA3.1-Cc

4、tA組通過轉染后的細胞存在綠色熒光的現(xiàn)象，同時pcDNA3.1-CctA重組質(zhì)粒表達的產(chǎn)物大小約是19kD，說明Vero細胞中的pcDNA3.1-CctA質(zhì)粒成功表達了CctA蛋白。BALB/c小鼠免疫學試驗表明，三免后，pcDNA3.1-cctA組和蛋白組的IgG1和IgG2a極顯著高于PBS組和pcDNA3.1組(P＜0.01)，PBS組和pcDNA3.1組的IgG1和IgG2a水平無顯著性差異(P＞0.05);蛋白組細胞因子IFN