表達GFP或BTV結構蛋白的小反芻獸疫疫苗株的構建及生物學特性研究.pdf

1、小反芻獸疫(Peste des petits ruminants)和藍舌病(Bluetongue)是嚴重危害山羊、綿羊等家養(yǎng)及野生反芻動物的烈性傳染性疾病;分別由小反芻獸疫病毒(Peste des petits ruminants virus，PPRV)和藍舌病病毒(Bluetongue virus，BTV)引起的病毒病。迄今為止，PPR和BT無特效藥，只能通過疫苗接種進行防治。
　　 反向遺傳操作作為病毒學技術，可利用該技術開

2、展RNA病毒各方面的研究，特別是將RNA病毒開發(fā)成病毒載體用于研發(fā)新型疫苗。曾有PPRV迷你基因組建立的報道，證明了PPRV反向遺傳操作系統(tǒng)建立的可行性，但此后一直未見PPRV成功救獲的報道，這嚴重阻礙了PPRV毒力機制、重組載體疫苗開發(fā)等方面的研究進展。為了能夠區(qū)分PPR自然感染和免疫感染并有效的對PPR進行防控，本研究采用反向遺傳操作技術，構建了表達兩種不同形式的GFP標記疫苗，并以此為基礎優(yōu)化病毒中和試驗;同時構建了表達我國12型

3、藍舌病病毒結構蛋白的PPRV全長cDNA并進行體外拯救，對獲救的重組病毒生物學特性進行分析而開展了系列研究:
　　 試驗Ⅰ.表達GFP的小反芻獸疫Nigeria75/1疫苗株的構建及生物學特性研究
　　 本研究根據PPRV Nigeria75/1疫苗株構建了的感染性全長cDNA，以此為基礎，構建了表達綠色熒光蛋白(GFP)的全長cDNA克隆。將插有GFP基因的全長cDNA(4μg/孔)克隆及三個輔助質粒pCA-N(2μg

4、/孔)、pCA-P(1μg/孔)和pCA-L(1μg/孔)采用脂質體轉染法轉入Vero細胞內，救獲病毒命名為rPPRV/GFP，首次拯救出了表達外源基因的PPRV重組病毒。該重組病毒在Vero細胞上的多步動力學生長曲線與親本毒株相似，其最高生長滴度可達107.4TCID50/mL;經間接免疫熒光(IFA)及蛋白免疫印跡(Western-blot)分析得知，重組病毒在Vero細胞上不僅能夠表達病毒自身抗原，也能夠表達GFP抗原;同時，將重

5、組病毒在Vero細胞上多次傳代，通過對傳代病毒的毒價滴定及GFP熒光強度的定量分析可知，重組病毒在傳代過程中依然能夠穩(wěn)定復制增殖并穩(wěn)定表達外源蛋白。rPPRV/GFP和wtPPRV/N75/1按103 TCID50的劑量各免疫山羊(0.5～1.5歲)4只，同時設置PBS注射的對照組(4只)，于免疫前及免疫后第2、4、6周采血進行PPRV中和抗體檢測，兩個毒株免疫的所有羊的PPRV中和抗體效價在免疫2周后全部轉陽性(＞10)，在6周內，兩

6、者抗體水平都基本維持不變。與wtPPRV/N75/1的效價比較，用GraphPad Prism軟件進行2way ANOVA分析，二者差異不顯著(P＞0.05)。結果表明重組毒株保持了親本毒株的免疫原性，在P和M基因之間插入外源基因并未影響到親本毒株的免疫原性。
　　 試驗Ⅱ.表達錨定型GFP的小反芻獸疫Nigeria75/1疫苗株的構建及生物學特性研究
　　 傳統(tǒng)的弱毒疫苗株免疫后，不能通過血清學方法區(qū)分PPR自然感染和

7、免疫感染。本研究在選用GFP作為標記蛋白的基礎上對其進行修飾，使其N端具有組織纖維蛋白溶酶抗原(tPA)的信號肽(SIG)，C端具有H3N2型流感病毒HA蛋白跨膜錨定序列(ANC)，之后構建出一株表達該錨定型GFP基因的小反芻獸疫病毒的全長cDNA克隆，該克隆連同三個輔助質粒一起經脂質體轉染法轉進Vero細胞內，獲得重組病毒并命名為rPPRV/GFP-SA。該重組病毒保持了親本毒株的生長學特性，在Vero細胞上的多步動力學生長曲線與親本

8、毒株相似，第5d病毒滴度可達峰值108.34 TCID50/mL;經間接免疫熒光(IFA)及蛋白免疫印跡(Western-blot)分析可知，重組病毒在Vero細胞上不僅能夠表達自身病毒抗原，也能夠表達修飾后的GFP抗原。通過激光共聚焦觀測，修飾后的GFP成功的錨定在Vero細胞膜上，細胞內殘留極少;而相應的未修飾的GFP則積聚在細胞質和細胞核內，未能錨定在細胞膜上。rPPRV/GFP和rPPRV/GFP-SA按105 TCID50的劑

9、量免疫2組(每組5只)0.5～1.5歲綿羊，間隔3周，相同劑量加強免疫1次，并于免疫前、一免3周及二免2周采血進行抗體分析。兩組羊在兩個時間點所測PPRV抗體，用GraphPad Prism軟件進行2way ANOVA分析，二者差異不顯著(P＞0.05)。但是rPPRV/GFP-SA免疫的羊的PPRV抗體水平與GFP抗體水平一定程度上呈正相關關系，其PPRV抗體效價高，對應的血清中就能檢測到GFP抗體，可能是因為頸部皮下免疫過程中存在扎

10、穿皮膚的情況而導致免疫失敗，待重新進行動物試驗驗證。而rPPRV/GFP幾乎不能誘導GFP抗體的產生，僅有1472一免后產生了GFP抗體但很快下降。
　　 試驗Ⅲ.表達12型BTV結構蛋白的小反芻獸疫Nigeria75/1疫苗株的構建及生物學特性研究
　　 藍舌病病毒的VP2蛋白是誘導BTV保護性中和抗體的主要免疫原，VP5蛋白雖然不然誘導病毒產生中和抗體，但是可以協助VP2蛋白產生更高水平的中和抗體;VP3、VP7蛋白

11、構成病毒內衣殼，VP7蛋白可以誘導機體產生保護性的反應;同時，VP2、VP5和VP7蛋白上有CTL表位。
　　 本研究成功構建了分別表達我國12型藍舌病病毒分離株的VP2、VP3、VP5和VP7基因的全長cDNA克隆，將4個全長cDNA分別與三個輔助質粒按照4∶2∶1∶1的比例混合后，采用脂質體轉染方法將混合物轉入Vero細胞內，體外成功拯救出重組病毒rPPRV/BTV12-VP5和rPPRV/BTV12-VP7。兩個重組病毒能

12、夠穩(wěn)定的復制增殖，在Vero細胞上的生長動力學曲線與親本毒株相似;同時，經間接免疫熒光(IFA)及免疫印跡(Western-blot)分析，獲救病毒在Vero內可以表達出VP5和VP7蛋白。rPPRV/BTV12-VP5和wtPPRV/N75/1按107 TCID50的劑量各免疫5只山羊(0.5～1.5歲)，同時設置PBS注射的對照組(5只)，3周后相同劑量加強免疫1次，于免疫前、一免3周和二免2周后采血進行中和抗體分析，所有羊在一免3

13、周全部轉陽(≥82.5)，二免2周抗體上升(≥325.5)，結果表明重組病毒和親本毒株一樣可以誘導動物機體產生高水平的PPRV保護性中和抗體，用GraphPad Prism軟件進行2way ANOVA分析，二者差異不顯著(P＞0.05)，但是在山羊體內誘導產生的VP5抗體水平不高。研究結果表明，rPPRV/BTV12-VP5保持Nigeria75/1弱毒疫苗株生物學特性、免疫學特性，可以有效的表達VP5蛋白但是卻不能有效的誘導動物機體產

14、生針對VP5蛋白的抗體，這可能和VP5蛋白自身免疫原性有關。由于時間關系，表達VP7蛋白的重組病毒未能進行動物試驗，同時構建的表達VP2和VP3基因的PPRV全長cDNA可能因為插入外源基因太長或其他原因至今尚未拯救出重組病毒。但是重組病毒rPPRV/BTV12-VP5和rPPRV/BTV12-VP7的成功拯救，為將來研發(fā)安全有效的藍舌病及小反芻獸疫重組二聯活疫苗奠定了基礎。
　　 試驗Ⅳ.表達GFP的重組小反芻獸疫病毒在病毒中

15、和試驗中的應用
　　 有效的診斷方法是PPR防控及疫苗效率檢測的重要措施之一，病毒中和試驗(VNT)作為黃金標準被OIE推薦，該方法靈敏、特異、結果可靠，但缺點是太耗時，而且CPE結果的觀察需要有經驗人士進行觀察，特別是在低濃度稀釋血清時，我們無法區(qū)分是血清內的可能存在的有毒物質導致還是病毒引起的細胞死亡。本研究在傳統(tǒng)的VNT的基礎上，用rPPRV/GFP替代wtPPRV/N75/1，首先選擇1份PPRV抗體陽性血清進行分析，采

16、用rPPRV/GFP作為檢測抗原的VNT，其結果通過觀察感染的Vero細胞發(fā)出的熒光即可，取代了觀察CPE，有效避免了在觀測結果時的觀察者主觀性的影響，同時確定了優(yōu)化后的VNT結果統(tǒng)計的最佳時間為第6d。隨后隨機挑選出rCPV-PPRVH免疫的山羊、綿羊血清各10份，以及wtPPRV/N75/1免疫的山羊血清10份，采用兩種VNT方法檢測這30份血清的PPRV抗體，二種檢測方法所獲得抗體效價經T-test分析后，P＞0.05，差異不顯著