鼻咽癌雙特異性抗獨(dú)特型抗體疫苗的生物學(xué)活性鑒定及免疫機(jī)制研究.pdf

1、第一章、鼻咽癌人源雙特異性抗獨(dú)特型抗體疫苗的制備及活性鑒定
　　 目的：構(gòu)建能夠表達(dá)全人源鼻咽癌雙特異性抗獨(dú)特型抗體的原核表達(dá)載體pET25b-G22-I50及單價(jià)抗獨(dú)特型抗體的原核表達(dá)載體pET25b-G22、pET25b-I50，并對(duì)其表達(dá)產(chǎn)物作初步鑒定。
　　 方法：利用分子克隆技術(shù)依次或分別將G22、I50插入到原核表達(dá)載體pET25b(+)中，轉(zhuǎn)化入E.coli DH5α，經(jīng)菌落PCR、雙酶切驗(yàn)證并測(cè)序。將陽性

2、重組子轉(zhuǎn)化入表達(dá)菌株E.coli BL21(DE3)，經(jīng)IPTG誘導(dǎo)表達(dá)后，表達(dá)的重組蛋白經(jīng)His-tag純化試劑盒純化后復(fù)性。用Western blot方法鑒定抗獨(dú)特型抗體G22-I50、G22、I50的表達(dá)，ELISA方法分析其蛋白活性。
　　 結(jié)果：構(gòu)建的原核表達(dá)載體pET25b-G22-I50、pET25b-G22、pET25b-I50經(jīng)測(cè)序驗(yàn)證，序列正確。三種蛋白G22-I50、G22、I50均以包涵體形式高效表達(dá)，經(jīng)

3、純化后純度達(dá)90％以上。Western blot鑒定表達(dá)的蛋白相對(duì)分子質(zhì)量(Mr)分別約42000，27000，15000，與預(yù)期相符。ELISA方法鑒定復(fù)性后的蛋白均已恢復(fù)活性，能夠用于體外實(shí)驗(yàn)。
　　 結(jié)論：成功獲得了有活性的人源雙特異性抗獨(dú)特型抗體G22-I50及單價(jià)的抗獨(dú)特型抗體G22、I50，為研究鼻咽癌抗獨(dú)特型抗體疫苗的主動(dòng)免疫機(jī)制鑒定了堅(jiān)實(shí)的基礎(chǔ)。
　　 第二章、雙特異性抗獨(dú)特型抗體體外抗腫瘤免疫機(jī)制研究<

4、br>　　 目的：比較鼻咽癌雙價(jià)雙特異性抗獨(dú)特型抗體G22-I50與單價(jià)的抗獨(dú)特型抗體G22、I50在體外抗腫瘤免疫情況，并對(duì)其可能的機(jī)制作初。
　　 方法：誘導(dǎo)表達(dá)G22-I50、G22、I50三種蛋白并用Western blot及ELISA方法進(jìn)行活性鑒定。常規(guī)分離人外周血單個(gè)核細(xì)胞(PBMC)，分別用G22-I50、G22、I50抗獨(dú)特型抗體刺激并培養(yǎng)，采用MTT法、LDH釋放法分別觀察淋巴細(xì)胞增殖情況和細(xì)胞毒作用，EL

5、ISA方法測(cè)定用各抗獨(dú)特型抗體刺激后培養(yǎng)上清液中IFN-γ、IL-2、IL-4水平的變化，流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)刺激后淋巴細(xì)胞表型的改變。
　　 結(jié)果：與G22、I50組相比，G22-I50刺激后的PBMC增殖明顯，且對(duì)鼻咽癌細(xì)胞HNE2有特異的殺傷作用。G22-I50刺激后的PBMC培養(yǎng)上清液中IFN-γ、IL-2水平均比G22、I50組有所增加，而對(duì)IL-4水平?jīng)]有明顯影響。流式細(xì)胞術(shù)顯示刺激后的PBMC中CD4+、CD8+T細(xì)胞比

6、例增加，CD4/CD8的比率增加，而CD4+CD25+Treg細(xì)胞的比例有所減少，其中以G22-I50組最為明顯。
　　 結(jié)論：G22-I50具有更強(qiáng)的免疫原性并能增強(qiáng)PBMC的特異性殺瘤作用，其機(jī)制可能與促進(jìn)PBMC的增殖，誘導(dǎo)具有抗腫瘤作用的Th1細(xì)胞因子的分泌并活化CD8+T細(xì)胞，抑制CD4+CD25+Treg細(xì)胞的表達(dá)有關(guān)。
　　 第三章、雙特異性抗獨(dú)特型抗體體內(nèi)抗腫瘤免疫機(jī)制研究
　　 目的：分別利用B

7、alb/c小鼠和hu-PBL-SCID小鼠模型研究雙特異性抗體疫苗的抗腫瘤效應(yīng)，并對(duì)其可能的機(jī)制作深入探討。
　　 方法：將雙特異性抗獨(dú)特型抗體疫苗G22-I50及單價(jià)的抗獨(dú)特型抗體疫苗G22、I50分別免疫 Balb/c小鼠，通過間接ELISA、競(jìng)爭(zhēng)抑制ELISA法檢測(cè)各蛋白疫苗免疫后誘導(dǎo)的體液免疫反應(yīng)情況；通過淋巴細(xì)胞增殖實(shí)驗(yàn)檢測(cè)免疫后小鼠的細(xì)胞免疫反應(yīng)情況；通過檢測(cè)Th1，Th2型細(xì)胞因子的表達(dá)情況，以判斷各蛋白疫苗免疫后

8、的免疫反應(yīng)類型。以腹腔注射PBMC法重建SCID小鼠的免疫系統(tǒng)并進(jìn)行鑒定，分別將上述幾種抗獨(dú)特型抗體疫苗免疫h(yuǎn)u-PBL-SCID小鼠，并接種鼻咽癌細(xì)胞HNE2，或先接種HNE2細(xì)胞后再用各種疫苗免疫h(yuǎn)u-PBL-SCID小鼠，評(píng)價(jià)疫苗的抗腫瘤免疫保護(hù)與免疫治療作用。定期檢測(cè)腫瘤體積、記錄腫瘤形成的潛伏期，生存時(shí)間，并對(duì)腫瘤組織作病理學(xué)檢查。同時(shí)，用雙抗夾心ELISA法檢測(cè)脾淋巴細(xì)胞培養(yǎng)上清中細(xì)胞因子的分泌情況，用LDH法檢測(cè)脾淋巴細(xì)胞

9、的殺傷活性，以FCM法、免疫組織化學(xué)法檢測(cè)腫瘤組織周圍浸潤(rùn)的淋巴細(xì)胞情況。
　　 結(jié)果：分別用G22-I50、G22、I50免疫Balb/c小鼠后，通過間接ELISA和競(jìng)爭(zhēng)抑制ELISA法檢測(cè)發(fā)現(xiàn)，G22-I50免疫后小鼠能夠產(chǎn)生較高水平的Ab3抗體，且具有較強(qiáng)的競(jìng)爭(zhēng)結(jié)合HNE2細(xì)胞相關(guān)抗原的能力；G22-I50免疫后小鼠的脾淋巴細(xì)胞具有較強(qiáng)的增殖能力，并能表達(dá)高水平的IFN-γ、IL-2。成功的重建了SCID小鼠的免疫系統(tǒng)，并

10、通過免疫保護(hù)實(shí)驗(yàn)、免疫治療實(shí)驗(yàn)對(duì)其抗腫瘤效應(yīng)進(jìn)行了評(píng)估，發(fā)現(xiàn)G22-I50能夠延長(zhǎng)腫瘤形成的潛伏期，生存時(shí)間，能夠抵抗腫瘤的生長(zhǎng)，并通過病理學(xué)檢查得以證實(shí)。通過EL，ISA法檢測(cè)發(fā)現(xiàn)G22-I50組的脾淋巴細(xì)胞分泌的細(xì)胞因子最多，且以Th1型細(xì)胞因子為主，脾淋巴細(xì)胞的特異性殺傷能力也有明顯增強(qiáng)，以FCM法、免疫組織化學(xué)法檢測(cè)發(fā)現(xiàn)G22-I50組腫瘤周圍浸潤(rùn)的CD4+CD25+Treg細(xì)胞顯著減少，CD3+T細(xì)胞顯著增加。
　　

11、結(jié)論：G22-I50能夠同時(shí)激活機(jī)體的體液免疫反應(yīng)和細(xì)胞免疫反應(yīng)，并能誘導(dǎo)Th1細(xì)胞因子的分泌，促進(jìn)CD3+T細(xì)胞的浸潤(rùn)，抑制CD4+CD25+rreg細(xì)胞的浸潤(rùn)，從而發(fā)揮其抗腫瘤效應(yīng)。
　　 第四章、含人GM-CSF的雙特異性抗獨(dú)特型抗體融合蛋白疫苗免疫應(yīng)答及免疫保護(hù)機(jī)制研究
　　 目的：構(gòu)建并表達(dá)含人GM-CSF的雙特異性抗獨(dú)特型抗體疫苗GM-CSF-G22-I50，觀察人GM-CSF和G22-I50的協(xié)同抗腫瘤作用

12、，并對(duì)其機(jī)制作探討。
　　 方法：常規(guī)分離人PBMC并抽提其RNA，PCR擴(kuò)增GM-CSF基因，分別插入空載體pET25b(+)和已構(gòu)建的重組質(zhì)粒pET25b-G22-150的上游多克隆位點(diǎn)，構(gòu)建重組質(zhì)粒pET25b-GM-CSF，pET25b-GM-CSF-G22-I50，以酶切和測(cè)序法進(jìn)行鑒定。通過誘導(dǎo)表達(dá)、純化、復(fù)性等一系列過程獲得有活性的GM-CSF、GM-CSF-G22-I50蛋白，并用Western blot、ELI

13、SA方法來驗(yàn)證蛋白的活性。將不同的蛋白疫苗GM-CSF、G22-I50、GM-CSF-G22-I50分別于背部皮下接種Balb/c小鼠，PBS免疫作為陰性對(duì)照，分別通過間接ELISA、競(jìng)爭(zhēng)抑制ELISA法，淋巴細(xì)胞增殖實(shí)驗(yàn)、細(xì)胞毒性實(shí)驗(yàn)檢測(cè)免疫小鼠的體液免疫和細(xì)胞免疫反應(yīng)情況，并通過雙抗夾心ELISA法檢測(cè)免疫小鼠的細(xì)胞因子分泌情況。以腹腔注射PBMC法重建SCID小鼠的免疫系統(tǒng)，分別將上述幾種抗獨(dú)特型抗體疫苗免疫h(yuǎn)u-PBL-SCID

14、小鼠，并接種鼻咽癌細(xì)胞HNE2，定期檢測(cè)腫瘤體積、記錄腫瘤形成的潛伏期，生存時(shí)間；以RT-PCR法檢測(cè)了腫瘤組織中轉(zhuǎn)錄因子T-bet、GATA-3、RORγt、Foxp3的表達(dá)情況，并檢測(cè)了腫瘤組織中ITAC及脾細(xì)胞中CXCR3的表達(dá)，以雙抗夾心ELISA法檢測(cè)了小鼠脾細(xì)胞培養(yǎng)上清中IFN-γ、IL-4、IL-10、IL-17和TGF-γ的水平，以評(píng)價(jià)各疫苗的抗腫瘤效應(yīng)。
　　 結(jié)果：成功的構(gòu)建了原核表達(dá)載體pET25b-GM-

15、CSF，pET25b-GM-CSF-G22-I50，并獲得了有活性的GM-CSF、GM-CSF-G22-I50蛋白。將各種蛋白疫苗免疫Balb/c小鼠后，通過間接ELISA、競(jìng)爭(zhēng)抑制ELISA法檢測(cè)發(fā)現(xiàn)GM-CSF-G22-I50蛋白免疫組小鼠體內(nèi)能夠產(chǎn)生較強(qiáng)的Ab3抗體，且該抗體可以與Ab1(FC2 mAb)競(jìng)爭(zhēng)結(jié)合HNE2細(xì)胞相關(guān)抗原；淋巴細(xì)胞增殖實(shí)驗(yàn)顯示，各組免疫小鼠的脾臟淋巴細(xì)胞在體外經(jīng)1μg/mL蛋白刺激后，淋巴細(xì)胞增殖能力最

16、強(qiáng)，且以GM-CSF-G22-I50蛋白免疫組為著，分泌的細(xì)胞因子主要以Th1型細(xì)胞因子為主；細(xì)胞毒性實(shí)驗(yàn)結(jié)果發(fā)現(xiàn)，與G22-I50、GM-CSF、PBS組相比，GM-CSF-G22-I50組小鼠脾淋巴細(xì)胞對(duì)HNE2細(xì)胞的特異性殺傷作用明顯增強(qiáng)。利用hu-PBL-SCID小鼠模型，觀察各疫苗的抗腫瘤免疫保護(hù)作用，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，與G22-I50、GM-CSF、PBS組相比，GM-CSF-G22-I50蛋白免疫組小鼠的腫瘤形成潛伏期明顯延長(zhǎng)，腫

17、瘤體積減小，生存時(shí)間延長(zhǎng)；RT-PCR法檢測(cè)發(fā)現(xiàn)，GM-CSF-G22-I50組小鼠腫瘤組織周圍T-bet、GATA-3、RoRγt、ITAC及脾細(xì)胞CXCR3的表達(dá)明顯增加，且脾細(xì)胞培養(yǎng)上清中分泌的細(xì)胞因子IFN-γ、IL-4、IL-17明顯增多，而IL-10、TGF-β明顯減少。
　　 結(jié)論：含人GM-CSF的雙特異性抗獨(dú)特型抗體融合蛋白疫苗能夠顯著增強(qiáng)體液免疫、細(xì)胞免疫反應(yīng)能力，從而發(fā)揮其抗腫瘤免疫保護(hù)作用，這可能與腫瘤周