重組pGH原核表達(dá)產(chǎn)物純化及其生物活性研究.pdf

1、本研究首先將克隆到的豬生長(zhǎng)激素(pGH)基因cDNA編碼區(qū)片段定向插入pGEX1-λT載體，轉(zhuǎn)化大腸桿菌TOP10F’，用菌落PCR和質(zhì)粒PCR方法篩選陽性克??；以BamHI和EcoRI酶切鑒定重組質(zhì)粒。以IPTG誘導(dǎo)融合蛋白表達(dá)，產(chǎn)物經(jīng)SDS-PAGE分析。得到高效表達(dá)豬GH的重組質(zhì)粒pGEX1-λT-pGH，SDS-PAGE分析證明誘導(dǎo)重組質(zhì)粒菌株表達(dá)了融合蛋白，分子量約為50KDa，與預(yù)期的26KDa的GST帶和24.4KDa的豬

2、生長(zhǎng)激素基因編碼蛋白質(zhì)構(gòu)成的融合蛋白大小一致?！　木郾０分苽淠z中回收正確表達(dá)的融合蛋白，以此免疫新西蘭白兔，制備得到滴度為1：6400的兔抗pGH高免血清。在此基礎(chǔ)上，完成了對(duì)抗體的純化和鑒定。采用辛酸－硫酸銨法對(duì)制得的多克隆抗體進(jìn)行純化，用紫外分光光度計(jì)檢測(cè)純化抗體蛋白含量，SDS-PAGE檢測(cè)抗體純度，用蛋白質(zhì)印跡分析和免疫組化分析檢查了純化后抗體的免疫活性。結(jié)果顯示：經(jīng)辛酸－硫酸銨純化抗體純度達(dá)到PAGE純，含量為19.

3、2mg/ml；純化后的pGH多抗與從豬垂體提取的天然pGH蛋白分子(24KDa)和表達(dá)融合蛋白(50KDa)均有特異性結(jié)合能力。純化后的pGH多抗以1：150的滴度檢測(cè)到豬垂體前葉細(xì)胞的細(xì)胞質(zhì)有pGH免疫陽性信號(hào)。在上述基礎(chǔ)上進(jìn)行了表達(dá)包涵體的變性復(fù)性研究和重組pGH的生物活性研究。菌體用裂解緩沖液(Tris-HCl50mmol/L,EDTA0.5mmol/L,NaCl50mmol；PH7.9)懸浮，加入20％脫氧膽酸鈉(DOC)水溶液