24601.手掌參γ硫素基因的原核表達及其表達產(chǎn)物的生物活性研究

1、分類號密級UDC注學(xué)位論文手掌參手掌參γ硫素硫素基因基因的原核的原核表達表達及其表達產(chǎn)物其表達產(chǎn)物的生物活性生物活性研究研究（題名和副題名）楊樹維楊樹維（作者姓名）指導(dǎo)教師姓名馮娟馮娟副教授教授電子科技大學(xué)電子科技大學(xué)成都成都（職務(wù)、職稱、學(xué)位、單位名稱及地址）申請學(xué)位級別碩士碩士專業(yè)名稱生物化學(xué)與分子生物學(xué)生物化學(xué)與分子生物學(xué)論文提交日期2011.4論文答辯日期2011.5學(xué)位授予單位和日期電子科技大學(xué)電子科技大學(xué)答辯委員會主席評閱人

2、2011年月日注1：注明《國際十進分類法UDC》的類號。摘要I摘要植物防御素是一類氨基端含有信號肽、羧基端含有保守半胱氨酸殘基的陽離子型分泌多肽，它屬于植物固有免疫系統(tǒng)的重要成員，不同的植物防御素發(fā)揮不同的功能。本研究旨在利用原核表達系統(tǒng)獲取可溶性的手掌參?硫素蛋白（命名為Gcthionin），并研究其體外活性及相關(guān)結(jié)構(gòu)信息。方法：方法：采用pET32a()作為原核表達載體，構(gòu)建重組質(zhì)粒，并以此為模板通過PCR定點突變獲得兩個突變體（T

3、10F、R31G），經(jīng)IPTG誘導(dǎo)獲得融合蛋白，并分別通過Ni2NTA親和層析柱和SDSPAGE對融合蛋白進行純化和鑒定；嘗試甲酸切割TrxGcthionin融合蛋白，并采用穩(wěn)態(tài)熒光光譜跟蹤檢測酸切割過程，TricineSDSPAGE檢測酸切割結(jié)果；采用瓊脂糖擴散分析法檢測融合蛋白及其突變體對多種細菌的抗性；采用Bernfeld法檢測融合蛋白對黃粉甲蟲α淀粉酶（TMA）和豬胰α淀粉酶（PPA）的抑制活性。此外，采用分子對接模擬Gcthi

4、onin與TMA的相互作用。結(jié)果：結(jié)果：測序結(jié)果表明：目標(biāo)基因gcthionin成功插入表達載體pET32a()，并成功引入AspPro酸水解位點；SDSPAGE檢測結(jié)果顯示TrxGcthionin及其突變體在大腸桿菌BL21(DE3)中能可溶性表達；融合蛋白酸切割過程內(nèi)源熒光的變化表明：色氨酸的最大熒光發(fā)射峰位置無明顯變化，Trp在400~500nm的磷光發(fā)射顯著增強；TricineSDSPAGE檢測結(jié)果顯示：在甲酸的作用下，融合蛋白