金葡菌腸毒素A基因及其突變體表達(dá)產(chǎn)物生物學(xué)活性研究.pdf

1、背景和目的： 葡萄球菌腸毒素A(staphylococcal enterotoxins A,SEA)是金黃色葡萄球菌產(chǎn)生的腸毒素之一,為SEA基因編碼的257個(gè)氨基酸組成的多肽.SEA是一種細(xì)菌超抗原,在極低劑量時(shí)即可直接與抗原提呈細(xì)胞(antigen presenting cell,APC)MHC Ⅱ類分子和T細(xì)胞抗原識(shí)別受體(T cell receptor,TCR) Vβ片段高親和力地結(jié)合,誘導(dǎo)T淋巴,.母細(xì)胞有絲分裂并促進(jìn)

2、T細(xì)胞釋放IL-1β、IL-2和TNF-γ等多種細(xì)胞因子,從而發(fā)揮抗腫瘤作用.因此,SEA具有被開發(fā)成升白細(xì)胞、抗腫瘤類藥物的前景.然而,SEA具有腸毒性,可引起嘔吐、腹瀉,并導(dǎo)致小鼠死亡.眾所周知,多肽或蛋白類毒素的毒性主要取決于分子中的活性基團(tuán),利用定位突變技術(shù)改變SEA分子中毒性相關(guān)活性基團(tuán)的氨基酸組成,極有可能獲得低或無(wú)毒性、保持促淋巴細(xì)胞增殖和抗腫瘤活性的SEA突變體. 本研究中,我們擴(kuò)增并克隆了不含信號(hào)肽序列的全長(zhǎng)S

3、EA基因,根據(jù)SEA分子中腸毒性相關(guān)位點(diǎn)Protein Data Bank預(yù)測(cè)結(jié)果并參考文獻(xiàn),采用引物突變法構(gòu)建了多個(gè)目的定位突變體及其原核表達(dá)系統(tǒng),并根據(jù)突變前后目的重組蛋白細(xì)胞毒性、促淋巴細(xì)胞增殖和抗腫瘤細(xì)胞活性變化對(duì)突變體進(jìn)行了篩選,以期為進(jìn)一步研發(fā)安全有效SEA突變體藥物奠定基礎(chǔ). 實(shí)驗(yàn)方法: 采用高保真PCR和T-A克隆法,從金黃色葡萄球菌ATCCl3565株DNA中擴(kuò)增并克隆了不含信號(hào)肽序列的SEA基因.采用

4、突變引物PCR構(gòu)建SEA基因定位突變體.建立SEA基因及其定位突變體原核表達(dá)系統(tǒng).Ni-NTA親和層析法提純表達(dá)的目的重組蛋白,SDS-PAGE鑒定,并對(duì)純化的重組蛋白進(jìn)行透析復(fù)性和濾過(guò)除菌.采用'FCIDso法測(cè)定目的重組蛋白對(duì)Vero細(xì)胞的細(xì)胞毒性.采用MTT比色法分別檢測(cè)不同濃度的目的重組蛋白促小鼠脾細(xì)胞增殖及對(duì)抑制KB及HL-60癌細(xì)胞株生長(zhǎng)的作用. 結(jié)果： 所克隆的SEA基因核苷酸序列與報(bào)道序列的相似性為100

5、﹪,7種突變體均在既定位置獲得預(yù)期的密碼子突變.rSEA和各突變體重組蛋白表達(dá)量約為細(xì)菌總蛋白的52﹪.rSEA對(duì)Vero細(xì)胞TCID<,50>為4.1 μg,其突變體重組蛋白分別為5.8～23.5μg.1和5 μg/ml的rSEA及其5種突變體重組蛋白rSEA/I-1187A、rSEA/tt225A、rSEA/D227A、rSEA/H187A/D227A和rSEA/H225A/D227A對(duì)小鼠脾細(xì)胞均有明顯的促增殖作用(P<0.05)

6、,10和20 μg/ml的rSEA及上述5種突變體重組蛋白促小鼠脾細(xì)胞增殖活性與100 μG/ml PHA相似(P>0.05).5～20 μg/ml的rSEA及上述5種突變體重組蛋白作用的小鼠脾細(xì)胞上清及其上清與脾細(xì)胞混合物均能有效地抑制KB和HL-60細(xì)胞生長(zhǎng)(P<0.05). 結(jié)論： 本研究成功地構(gòu)建了SEA基因突變體及其高效原核表達(dá)系統(tǒng),其表達(dá)產(chǎn)物的細(xì)胞毒性均有所降低.由于rSEA/H225A、rSEA/D227A