腺病毒介導的SPK基因及其突變體表達調(diào)節(jié)內(nèi)皮細胞遷移.pdf

1、內(nèi)皮細胞的遷移是血管生成的重要啟動過程.多種血管生長因子如:內(nèi)皮細胞生長因子(VEGF),肝細胞生長因子(HGF)等通過復雜的信號途徑誘導細胞的遷移.細胞內(nèi)鞘氨醇激酶(SPK)是催化鞘氨醇生成1-磷酸鞘氨醇(S1P)的限速酶.S1P是具有很強促血管生成活性的脂類分子,通過細胞內(nèi)和細胞外兩種機制參與細胞遷移的調(diào)節(jié).細胞內(nèi)S1P可以作為第二信使參與血管生成信號的轉導.分泌到細胞外S1P與細胞膜表面的特異G蛋白偶聯(lián)受體—內(nèi)皮細胞分化基因(ED

2、G)結合,調(diào)節(jié)或激活多種細胞遷移信號.因此,SPK是細胞遷移活動中的重要信號分子.多種細胞因子通過不同的信號途徑激活細胞內(nèi)的SPK.HGF,又稱擴散因子(SF)具有非常強的誘導細胞遷移的作用.我們的研究證明HGF和受體c-Met相互作用可以激活內(nèi)皮細胞的SPK,但是,SPK在HGF誘導的細胞遷移中的作用并不清楚.為此,我們構建并制備了攜帶人SPK野生型和突變體基因的重組腺病毒載體,利用腺病毒載體介導的基因轉移方法將SPK野生型基因或其突

3、變體導入內(nèi)皮細胞,評價了SPK在HGF誘導內(nèi)皮細胞遷移中的作用.我們利用Bgl Ⅱ、Not Ⅰ限制性內(nèi)切酶位點將全長SPK基因(SpKWT)及突變體SPK基因(SPKG82D)克隆至Ad-Easy腺病毒系統(tǒng)的穿梭載體Pshuttle-cmv,獲得Pshuttle-cmv-SPKWT及Pshuttle-cmv-SPKG82D;利用內(nèi)切酶將其線性化后,轉化BJ-AD-1感受態(tài)細胞,獲得Re-ad-SPKWT及Re-ad-SPKG82D腺病毒

4、重組質(zhì)粒.經(jīng)測序和酶切鑒定正確后,利用脂質(zhì)體介導的基因轉移方法,將Re-ad-SpKWT及Re-ad-SPKG82D轉染293細胞,獲得重組腺病毒rAd-SPKWT及rAd-SPKG82D;在293細胞中分別擴增rAd-SPKWT及rAd-SPKG82D純化病毒;以噬斑分析法測定病毒感染梯度.獲得了攜帶SPK基因的重組腺病毒.內(nèi)皮細胞ECV304表達HGF的受體c-Met.同時表達S1P的受體EDG,因此是研究HGF與SPK關系的理想模

5、型.我們利用細胞擴散盒技術確定了HGF誘導ECV304細胞遷移的作用.另外,HGF和c-Met結合可以激活細胞內(nèi)SPK的活性.我們分別利用攜帶SPK野生型基因和突變體基因的重組腺病毒感染ECV304細胞.發(fā)現(xiàn)細胞內(nèi)野生型SPK基因過表達可明顯增強HGF誘導的內(nèi)皮細胞遷移;而表達SPK突變體基因阻斷內(nèi)源性SPK酶的活性則可以抑制HGF誘導的ECV304細胞的遷移.研究結果表明,SPK參與調(diào)控HGF/c-Met誘導的內(nèi)皮細胞遷移的信號轉導.