丙肝病毒非結(jié)構(gòu)基因NS5A的克隆表達及其缺失突變體的基因表達譜芯片分析.pdf

1、鄭州大學(xué)碩士學(xué)位論文丙肝病毒非結(jié)構(gòu)基因NS5A的克隆表達及其缺失突變體的基因表達譜芯片分析姓名：陳立冬申請學(xué)位級別：碩士專業(yè)：內(nèi)科學(xué)（消化）指導(dǎo)教師：張連峰20070524鄭州大學(xué)碩士學(xué)位論文丙肝病毒非結(jié)構(gòu)基聞NS5A的兜隆表達及其缺失突變體的基閃表達譜芯片分析NS5A的轉(zhuǎn)錄激活區(qū)域包括兩個酸性氨基酸區(qū)(2143218422202273氨基酸殘基)和一個脯氨酸富集xE(22822327氨基酸殘基)，這些區(qū)域被認(rèn)為是NS5A的轉(zhuǎn)錄活性區(qū)域

2、。對NS5AJ注行研究，找出NS5A：／笙肝細(xì)胞中的表達對肝細(xì)胞基因表達譜產(chǎn)生的影響，并進一步弄清具體作用機制、作用效應(yīng)及連帶影響，對明確HCV的致病機制，尋找有效防治方法具有重要意義。方法1根據(jù)文獻【6】及NCBI的Genbank上公布的HCVIb型基因序列，設(shè)計PCR產(chǎn)物片段包含NS5A的特異性引物，以從病人血清中提取的以HCVIb型RNA為模板，，利用RTPCR方法擴增出1632bp片段，連接至pGEMT載體并送測序，根據(jù)測序結(jié)果

3、設(shè)計PCR產(chǎn)物為NS5A的特異性引物以上述連接至pGEMT載體1632bp片段為模板擴增出1341bp片段連接至pGEMT載體并送測序。2將上述引入酶切位點艮覦礦和肺耐肼功pGEMTNS5A和pET32a()空質(zhì)粒經(jīng)EcoRV和Hindlll雙酶切，酶切片段回收后連接，測序正確后轉(zhuǎn)化BL21宿豐菌，05mM／mlIPTG、30℃誘導(dǎo)5hr，3根據(jù)l的測序結(jié)果設(shè)計NS5A缺失突變型l特異性引物。弓I入酶切位點勛村和HindlIl以pGEM

4、TNS5A質(zhì)粒為模板，PCR擴增出591bp片段，插入至真核表達載體pcDNA3。l(一)／myc中，測序完全正確，表明NS5A缺失突變型1真核表達載體的構(gòu)建成功。4用3構(gòu)建的pcDNA3。l／myeHis(一)ANS5ADMI真核表達重組質(zhì)粒，與空質(zhì)粒分別轉(zhuǎn)染HepG2細(xì)胞并獲得表達，兩者瓦為平行對照，提取轉(zhuǎn)染后的細(xì)胞總RNA，應(yīng)用摹因表達譜芯片技術(shù)檢測HepG2在NS5A缺失突變體轉(zhuǎn)染后差異表達的摹因譜的變化。結(jié)果INS5A測序結(jié)果