腺病毒介導(dǎo)雙自殺基因選擇性殺傷血管內(nèi)皮細(xì)胞的研究.pdf

1、目的:研究腺病毒介導(dǎo)的雙自殺基因在KDR啟動(dòng)子調(diào)控下對(duì)血管內(nèi)皮細(xì)胞的選擇性殺傷作用,為進(jìn)一步開展腫瘤血管的靶向治療研究奠定基礎(chǔ).首先利用改進(jìn)的AdEasy系統(tǒng)構(gòu)建攜帶KDR啟動(dòng)子/CMV啟動(dòng)子調(diào)控的雙自殺基因的重組復(fù)制缺陷型腺病毒.針對(duì)傳統(tǒng)的細(xì)菌內(nèi)同源重組法制備腺病毒過程仍較復(fù)雜,成功率低和對(duì)實(shí)驗(yàn)室條件要求高等缺點(diǎn),通過先構(gòu)建AdEasier-1細(xì)菌后進(jìn)行細(xì)菌內(nèi)同源重組的"兩步轉(zhuǎn)化法"來簡化實(shí)驗(yàn)過程,縮短實(shí)驗(yàn)周期,提高成功率.構(gòu)建好的腺

2、病毒用于感染HUVEC細(xì)胞和LoVo細(xì)胞,測(cè)定感染效率,檢測(cè)轉(zhuǎn)基因的表達(dá),對(duì)轉(zhuǎn)基因細(xì)胞施以前藥(5-FC和/或GCV),觀察轉(zhuǎn)基因細(xì)胞對(duì)前藥的敏感性,比較不同轉(zhuǎn)基因細(xì)胞對(duì)前藥的敏感性差異.方法:一、構(gòu)建重組腺病毒 應(yīng)用PCR擴(kuò)增出KDR啟動(dòng)子、CD基因、TK基因序列,構(gòu)建pKDR-CDglyTK質(zhì)粒;以Adeasy-1系統(tǒng)為載體,采用細(xì)菌內(nèi)同源重組"兩步轉(zhuǎn)化法"構(gòu)建攜帶KDR啟動(dòng)子調(diào)控下的CD與TK的融合基因腺病毒重組質(zhì)粒pAdKDR-

3、CDglyTK,同法構(gòu)建pAdCMV-CdglyTK質(zhì)粒.重組質(zhì)粒在293細(xì)胞中包裝成病毒,并進(jìn)一步擴(kuò)增、純化,通過在熒光顯微鏡下觀察細(xì)胞中綠色熒光蛋白(GFP)的表達(dá)觀察重組病毒的包裝與復(fù)制,PCR-5-鑒定重組腺病毒.二、基因轉(zhuǎn)移及前藥敏感實(shí)驗(yàn).以不同的MOI的重組病毒體外感染HUVEC和LoVo細(xì)胞,利用重組病毒攜帶的GFP基因,在熒光顯微鏡下觀測(cè)重組病毒的感染效率,并給予不同濃度的GCV和/或5-FC,觀測(cè)、比較不同前藥或前藥聯(lián)

4、合對(duì)不同轉(zhuǎn)基因細(xì)胞的殺傷作用.結(jié)論:一.KDR啟動(dòng)子—雙自殺基因系統(tǒng)對(duì)臍靜脈內(nèi)皮細(xì)胞具有強(qiáng)烈的殺傷作用,其殺傷效率與前藥濃度和重組病毒MOI相關(guān),聯(lián)合應(yīng)用兩種前藥較單用一種前藥更能有效的殺傷臍靜脈內(nèi)皮細(xì)胞.二.KDR基因啟動(dòng)子可調(diào)控雙自殺基因在血管內(nèi)皮細(xì)胞中特異性表達(dá),有利于實(shí)現(xiàn)雙自殺基因靶向惡性腫瘤血管內(nèi)皮細(xì)胞的抑癌療法.三.兩步轉(zhuǎn)化法是一種非常方便經(jīng)濟(jì)的腺病毒構(gòu)建方法,該法的廣泛應(yīng)用有利于以腺病毒為基因載體的轉(zhuǎn)基因工程的推廣和普及.