牛Myostatin突變體基因Pro區(qū)和生物活性區(qū)的克隆、表達(dá)與功能研究.pdf

1、肌肉生長抑制素,屬TGF-β超家族,是肌肉生長的一個(gè)負(fù)調(diào)控因子,肌抑素基因的突變?cè)斐?雙肌"現(xiàn)象,顯示肌抑素基因在物種進(jìn)化中的高度保守性.肌肉生長抑制素的突變動(dòng)物由于肌纖維數(shù)目的增加和肌纖維的變粗在骨骼肌的產(chǎn)量上顯示大量的增加.采取純種皮爾蒙特牛全血,提取基因組DNA.根據(jù)GeneBank已發(fā)表牛Myostatin cDNA的同源序列,選擇高度保守區(qū)域設(shè)計(jì)引物,采用PCR的方法從皮爾蒙特牛全基因組中擴(kuò)增得到Myostatin的三個(gè)外顯子

2、,將外顯子1、2連接構(gòu)成去除信號(hào)肽牛肌抑素基因突變體的Pro區(qū),外顯子3的生物活性區(qū),分別克隆于pMD18-T載體,對(duì)克隆的目的基因片段測(cè)序和酶切鑒定結(jié)果表明,其ORF正確.將目的片段克隆于高效原核表達(dá)載體pET30a(+)中,組裝成表達(dá)載體pET30a(+)/Myostatin/Pro和pET30a(+)/Myostatin/action.將這兩個(gè)表達(dá)載體轉(zhuǎn)化大腸桿菌表達(dá)菌株BL21中,經(jīng)異丙基硫代-β-D-半乳糖苷(IPTG)誘導(dǎo),

3、N端具有His<,6>肽的融合蛋白重組r Myostation/action得到高效表達(dá),表達(dá)產(chǎn)物約占菌體總蛋白的38％.表達(dá)產(chǎn)物的表觀分子量為15KD,而pET30a(+)/Myostatin/Pro表達(dá)量較低,增加表達(dá)菌株培養(yǎng)液的鹽離子濃度,可提高表達(dá)產(chǎn)物的百分含量達(dá)到30％,表達(dá)產(chǎn)物的表觀分子量為26KD.分別將表達(dá)蛋白純化,經(jīng)柱層析純化表達(dá)產(chǎn)物,表達(dá)產(chǎn)物Myostatin/Pro產(chǎn)量約為80ug/mL,Myostatin/act

4、ion的產(chǎn)量約為60ug/mL.分離綿羊的骨骼肌肌肉細(xì)胞,用含10％小牛血清DMEM/F12培養(yǎng)液,在37℃,5％CO<,2>條件下傳代培養(yǎng),該細(xì)胞經(jīng)PBS漂洗、胰酶消化,用上述培養(yǎng)液制成細(xì)胞懸液,接種到24孔板繼續(xù)培養(yǎng).24h后,吸棄培養(yǎng)液,測(cè)定組加入0.5ml培養(yǎng)液和10ul不同濃度Myostatin活性區(qū)蛋白樣品,對(duì)照組加入0.5ml培養(yǎng)液和10ul的PBS,室溫孵育20min,再加入培養(yǎng)液使每孔體積為0.8ml,48h后,重復(fù)上