抗人CD154人-鼠嵌合抗體Fab片段的制備及其結(jié)合活性的研究.pdf

1、該研究利用該實(shí)驗(yàn)室特有的抗人CD154單克隆抗體4F1,運(yùn)用RT-PCR技術(shù),從4F1雜交瘤細(xì)胞中克隆出抗人CD154單抗的可變區(qū)基因,并與人免疫球蛋白I gG1的恒定區(qū)基因重組成抗人CD154人-鼠嵌合抗體Fab融合基因,構(gòu)建嵌合Fab共表達(dá)載體pTXB1-Fab,利用大腸桿菌表達(dá)簡單,高效,成本低廉的特點(diǎn),對重組抗體進(jìn)行原核表達(dá).實(shí)驗(yàn)表明聯(lián)合應(yīng)用各種表達(dá)優(yōu)化條件,包括降低溫度,減少IPTG濃度,延長誘導(dǎo)時(shí)間可獲得可溶性蛋白表達(dá),且蛋

2、白表達(dá)動(dòng)力學(xué)分析表明:在0.05smmol/L IPTG,1﹪蔗糖,18℃,誘導(dǎo)16h可獲得可溶性蛋白表達(dá).以羊抗人IgG(H+L)多抗為一抗,兔抗羊IgG為二抗,Western-blot檢測,結(jié)果顯示兩條特異性條帶,分子量大小約為25kD、27kD,與重、輕鏈蛋白理論值基本一致,且目的條帶深淺一致,說明重輕鏈表達(dá)基本平衡,進(jìn)而表明構(gòu)建的共表達(dá)載體在原核細(xì)胞中得到了較好的表達(dá).為了研究其活性和抗原結(jié)合能力,用競爭抑制實(shí)驗(yàn)檢測Fab結(jié)合的

3、特異性,選取高表達(dá)人CD154的CD154-L929轉(zhuǎn)基因細(xì)胞(CD154-TC)與rcFab反應(yīng),競爭性抑制鼠單抗4F1與CD154-TC的結(jié)合,陽性對照為CD154-TC加4F1,陰性對照只加熒光二抗.總之,該實(shí)驗(yàn)成功克隆獲得阻斷型抗人CD154 mAb(4F1)單克隆抗體的輕鏈、重鏈可變區(qū)基因人及免疫球蛋白IgG1恒定區(qū)基因,并且拼接完成了完整的嵌合重鏈和嵌合輕鏈基因,成功構(gòu)建pTXB1-Fab共表達(dá)載體,在大腸桿菌中實(shí)現(xiàn)可溶性表