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文檔簡介
1、該研究利用該實驗室特有的抗人CD154單克隆抗體4F1,運用RT-PCR技術,從4F1雜交瘤細胞中克隆出抗人CD154單抗的可變區(qū)基因,并與人免疫球蛋白I gG1的恒定區(qū)基因重組成抗人CD154人-鼠嵌合抗體Fab融合基因,構建嵌合Fab共表達載體pTXB1-Fab,利用大腸桿菌表達簡單,高效,成本低廉的特點,對重組抗體進行原核表達.實驗表明聯(lián)合應用各種表達優(yōu)化條件,包括降低溫度,減少IPTG濃度,延長誘導時間可獲得可溶性蛋白表達,且蛋
2、白表達動力學分析表明:在0.05smmol/L IPTG,1﹪蔗糖,18℃,誘導16h可獲得可溶性蛋白表達.以羊抗人IgG(H+L)多抗為一抗,兔抗羊IgG為二抗,Western-blot檢測,結果顯示兩條特異性條帶,分子量大小約為25kD、27kD,與重、輕鏈蛋白理論值基本一致,且目的條帶深淺一致,說明重輕鏈表達基本平衡,進而表明構建的共表達載體在原核細胞中得到了較好的表達.為了研究其活性和抗原結合能力,用競爭抑制實驗檢測Fab結合的
3、特異性,選取高表達人CD154的CD154-L929轉基因細胞(CD154-TC)與rcFab反應,競爭性抑制鼠單抗4F1與CD154-TC的結合,陽性對照為CD154-TC加4F1,陰性對照只加熒光二抗.總之,該實驗成功克隆獲得阻斷型抗人CD154 mAb(4F1)單克隆抗體的輕鏈、重鏈可變區(qū)基因人及免疫球蛋白IgG1恒定區(qū)基因,并且拼接完成了完整的嵌合重鏈和嵌合輕鏈基因,成功構建pTXB1-Fab共表達載體,在大腸桿菌中實現(xiàn)可溶性表
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