抗CD45人-鼠嵌合抗體的構(gòu)建、表達與鑒定.pdf_第1頁
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文檔簡介

1、研究背景:急性髓系白血病(AML)是一種常見的惡性血液系統(tǒng)疾病,雖然化放療和造血干細胞移植技術的應用提高了患者的生存率,但仍有60%~70%遭受該疾病痛苦的病人死于AML。放化療后的造血干細胞移植只是為許多耐藥白血病類型病人提供了一種治愈的機會,盡管有許多研究團隊已證明了這種治療方法的有效、安全和可行性。研究證明針對白血病前體細胞和骨髓造血干細胞進行靶向放療最安全的方法就是用放射物標記的抗體直接靶向白血病細胞或正常骨髓造血干細胞。用單克

2、隆抗體治療急性髓性白血病早已有所報道,常用的抗體靶向標志有CD33、CD66和CD45,而現(xiàn)行研究認為抗CD45的抗體是最具研發(fā)前景的。
   CD45抗原是一種穩(wěn)定、高表達于所有白細胞和他們的前體細胞以及超過70%的骨髓有核細胞表面上的單鏈細胞膜糖蛋白,CD45又被稱為GP180、T200或白細胞共同抗原(LCA),是一種分子量約為200 kDa的酪氨酸磷酸酶,它穩(wěn)定表達于除成熟紅細胞和血小板外的所有造血細胞,且不存在于非造血

3、組織中,使之成為治療白血病的一個誘人的靶點。
   CD45能廣泛的表達于幾乎所有的白細胞,包括骨髓的髓系前體細胞和淋巴結(jié)中的成熟淋巴細胞以及90%的AML細胞,這些細胞和組織為病人治療的緩解或復發(fā)提供了大量抗體結(jié)合位點。由于CD45作為白細胞的標記物能出現(xiàn)在正常和惡性細胞,所以在病人體內(nèi)應用抗CD45抗體可以通過代謝分布到骨髓、脾臟和淋巴結(jié)中與靶抗原結(jié)合,用于治療急性白血病。
   在放射免疫治療中,通常的做法是有選擇

4、地針對一個特定的抗原將放射性物質(zhì)運輸?shù)侥[瘤細胞。由于造血組織來源的細胞對放射線敏感和其上的靶抗原的高度可接近性,對血液系統(tǒng)腫瘤的放免治療一直被認為是最成功的。在AML和MDS的放免治療中,CD45抗原由于具有高表達和特異結(jié)合性而成為極具吸引力的靶向目標。放射性標記的抗CD45抗體可將輻射物質(zhì)運輸?shù)娇乖栃约毎椭苓叚h(huán)繞的抗原陰性細胞上。因此,放射免疫偶聯(lián)物不需要以高濃度綁定到每一個白血病細胞上或滲入骨髓或腫瘤細胞中引發(fā)致死性的DNA損傷

5、。在復發(fā)的白血病病人的放免治療中,即使腫瘤細胞不表達CD45抗原,也會由于圍繞其周圍的高表達CD45抗原的非惡性造血細胞所介導的旁觀者效應而被殺滅。在造血干細胞移植領域,CD45抗原的這些特性,能促進研究者針對它的放射性標記的系列抗體進行更加深入的研究,以便用于臨床的治療。
   隨著CD45分子異構(gòu)體的研究、流式細胞儀免疫分型的應用及抗CD45單抗的靶向治療研究等深入發(fā)展,CD45分子在免疫學和血液學方面的應用研究受到進一步的

6、關注。可以預期,CD45必將會在臨床相關疾病的診斷、治療和預后等方面發(fā)揮更大的作用。然而抗CD45單克隆抗體來源于小鼠,用于人體可誘導抗鼠抗體的產(chǎn)生。因此進行基因工程改造抗體具有重要實踐意義。我們實驗組已報道過了抗CD45單抗在AML治療中良好前景,由于治療中藥物仍存在毒性使我們一直致力于不斷的改進。
   鼠標源性全分子抗體由于具有高度免疫原性和巨大分子量在臨床治療應用局限很多,而且長期使用鼠單抗能誘發(fā)人抗鼠抗體(HAMA)的

7、反應導致過敏性反應和損傷對人體健康造成危害。為了減少親本鼠單抗的免疫原性,提高抗體在體內(nèi)增強免疫機制的能力,我們設想改造其成為人-鼠嵌合的基因工程抗體。我們用人源抗體的恒定區(qū)去取代親本鼠單抗的C區(qū),由于嵌合抗體中的C區(qū)為人源性的,所以該人-鼠嵌合抗體在保留了鼠單抗特異性的同時,又降低了鼠抗體對人體的免疫原性;而且還具有比小鼠抗體更強的介導補體和細胞對靶抗原的殺傷和吞噬作用。此外,在構(gòu)建嵌合抗體時,我們有目的地選擇了抗體的類型,使之能更有

8、效的發(fā)揮抗體的效用。我們將該單抗的可變區(qū)基因插入到含人恒定區(qū)的嵌合抗體專用表達載體pFUSE-CHIg和pFUSE2-CLIg,轉(zhuǎn)染CHO細胞表達、純化嵌合抗體。
   現(xiàn)在我們首次研究并報導這種新型抗CD45的鼠/人嵌合抗體(命名Chi-CD45),目前國內(nèi)外尚無將CD45單抗進行人源化改造的相關報道。體外試驗研究證明,抗體的競爭抑制試驗結(jié)果隨著單克隆抗體濃度的改變發(fā)生梯度變化。而補體介導的細胞殺傷作用發(fā)揮了嵌合抗體恒定區(qū)的功

9、能,它能通過增加嵌合抗體的濃度而抑制Jurkat/人PBMC增殖。
   本課題利用PCR技術擴增抗CD45單抗的輕鏈與重鏈基因,并插入pGEM-T載體中,將陽性克隆進行核苷酸序列分析,目的是獲得正確地基因,為進一步研究奠定基礎。
   目的:構(gòu)建抗CD45嵌合抗體的真核表達載體并實現(xiàn)在真核細胞中的表達。
   方法:通過PCR技術分別擴增抗CD45單克隆抗體的輕鏈與重鏈可變區(qū)基因片段;利用DNAtools,IM

10、GT/QUEST及EBI TOOLS:ClustalW2分析軟件對輕鏈和重鏈基因分別進行同源性比較。將經(jīng)過測序確認的基因序列分別構(gòu)建入嵌合抗體的表達載體中轉(zhuǎn)染CHO細胞,通過Western blotting檢測嵌合抗體的表達。對該嵌合抗體進行分子建模,模擬其蛋白質(zhì)二級、三級結(jié)構(gòu),并通過相關效應檢測進一步驗證該基因工程抗體四級結(jié)構(gòu)的完整和功能的有效性。收集細胞培養(yǎng)上清后,通過Protein A親和層析對表達產(chǎn)物進行純化;通過FACS檢測純

11、化后的嵌合抗體與靶細胞特異性結(jié)合的能力;與親本單抗的競爭抑制活性;在補體存在條件下的嵌合抗體Fc段介導的CDC效應能力,以及嵌合抗體抑制靶細胞增殖的活力。
   結(jié)果:PCR擴增出的VL、VH基因片段經(jīng)1%瓊脂糖凝膠電泳鑒定,其片段大小與理論值相符,DNA測序鑒定顯示其序列正確。經(jīng)分析軟件鑒定功能性輕鏈結(jié)構(gòu)域:從第16位堿基(ATG)開始,其后為57個bp的信號肽序列,編碼19個氨基酸;可變區(qū)全長為333個堿基,抗CD45單抗有

12、功能的輕鏈均屬于IG к V1-117’01家族,V區(qū)匹配率為99.32%,J區(qū)為100%。
   重鏈結(jié)構(gòu)域分析:從第16位堿基(ATG)開始,其后為57個bp的信號肽序列,編碼19個氨基酸;可變區(qū)全長為348個堿基,功能性重鏈屬于IGHV2-9-1’01家族。V區(qū)匹配率為96.84%,J區(qū)為87.23%。
   重組嵌合抗體的表達載體分別通過特異性引物經(jīng)PCR擴增鑒定顯示其產(chǎn)物片段大小與理論值相符,DNA測序鑒定顯示

13、其序列和閱讀框正確。共轉(zhuǎn)染CHO細胞經(jīng)篩選后顯示嵌合抗體表達量低,后續(xù)實驗結(jié)果不理想。重組抗體產(chǎn)量低是制備基因工程抗體最大的障礙,高表達細胞株相對于整個轉(zhuǎn)染細胞群是非常稀少的,在穩(wěn)定培養(yǎng)時產(chǎn)量可形成梯度下降,過度生長的非表達細胞亦可使整個穩(wěn)轉(zhuǎn)細胞產(chǎn)量下降更明顯,甚至形成非表達細胞群。
   大多數(shù)細胞系產(chǎn)生的IgG可合成更多的輕鏈基因,在對人鼠嵌合抗體雜交細胞系研究中,發(fā)現(xiàn)輕鏈分泌的比率和細胞內(nèi)的輕鏈含量存在相關性,它合成的速度

14、比重鏈要快幾倍,而且需要的量更多。有文獻報道分步轉(zhuǎn)染的方法,可以使表達有功能的細胞增加5~30%,先用高濃度抗生素穩(wěn)轉(zhuǎn)輕鏈基因待該細胞穩(wěn)定后再進一步轉(zhuǎn)染重鏈基因。在后續(xù)培養(yǎng)過程適量減少培養(yǎng)基用量,延長轉(zhuǎn)染細胞培養(yǎng)時間達7~10天以上均能相對提高抗體濃度,或選用DMSO,丁酸鈉等在能抑制細胞增長同時,促進抗體分泌尤其對CHO細胞重組蛋白質(zhì)有促進效果(產(chǎn)量提高約2倍)。
   參考相關文獻后我們采用了分步轉(zhuǎn)染的方法并用丁酸鈉間隔刺激

15、轉(zhuǎn)染細胞,ELISA結(jié)果顯示嵌合抗體產(chǎn)量有極大提高;分子模擬的各項檢測指標顯示了構(gòu)建的抗CD45人-鼠嵌合抗體符合完整有功能的基因工程抗體,Insight Ⅱ軟件模擬了抗CD45抗體的Fab段結(jié)構(gòu)域,該建模模型表明該抗體具有完整的抗原結(jié)合凹槽能穩(wěn)定的發(fā)揮抗體的相關功能。
   轉(zhuǎn)染瘤細胞經(jīng)檢測證實表達成功以后,部分轉(zhuǎn)染瘤細胞放入液氮中凍存,5個月后取出凍存的細胞復蘇培養(yǎng),先后經(jīng)過一次常規(guī)有限稀釋克隆和多次ELISA方法鑒定,證明

16、該轉(zhuǎn)染瘤細胞經(jīng)過液氮凍存及多次傳代,仍能夠保持良好的體外生長狀態(tài)。
   Western blotting結(jié)果顯示培養(yǎng)3天的轉(zhuǎn)染瘤細胞分泌的上清中有嵌合抗體表達。收集培養(yǎng)的上清經(jīng)Protein A親和層析純化后,SDS-PAGE鑒定顯示在純化產(chǎn)物中僅見嵌合抗體重鏈和輕鏈條帶,其分子量大小與理論值相符。FCM檢測顯示純化后的嵌合抗體分子的V區(qū)能夠與多株腫瘤細胞及人PBMC細胞表面CD45抗原特異性的結(jié)合,且其結(jié)合能力與相同濃度的鼠

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