人鼠嵌合型抗人CD19抗體Hm2E8b的研制及功能研究.pdf

1、單克隆抗體(單抗)特異性高,因此已經(jīng)廣泛用于疾病的診斷和治療,但是目前研制的單抗多為鼠源性的,在治療中反復使用,作為異源蛋白在人體內(nèi)可誘發(fā)產(chǎn)生人抗鼠免疫球蛋白抗體(HAMA),大大限制了它的臨床應用。只有將其進行人源化的改造,才能有效應用于臨床治療。人鼠嵌合型抗體是指通過基因工程的技術和方法,將鼠源性單抗的可變區(qū)與人抗體恒定區(qū)拼接形成的抗體。目前較為成熟的做法就是將鼠單抗的可變區(qū)構建成單鏈抗體與人Ig的Fc段結合,相對于其它人源化抗體具

2、有以下優(yōu)點:技術路線簡單,易于操作；鼠源抗體的親和力和特異性得到了很好的保留；抗體的完整性好,在體內(nèi)的潴留時間長。
　　 CD19分子是B淋巴細胞表面發(fā)揮特異性信號轉導的受體,存在于B細胞成熟的各個階段,在大多數(shù)的非霍奇金淋巴瘤(NHL)和許多白血病包括急性淋巴細胞白血病(ALL)和慢性淋巴細胞白血病(CLL)細胞上高表達,目前已成為免疫治療的一個重要靶點。目前針對B系惡性腫瘤的治療,已經(jīng)有一些CD19特異性抗體治療,包括非結合

3、抗體,藥物共軛抗體以及雙特異性的抗體如CD19-CD3等,在體外實驗、動物模型、以及早期的臨床實驗中取得了較為理想的結果。但是還遠沒能滿足臨床應用的需要,技術上也還存在不少問題,因此有必要研究更多的CD19抗體。
　　 ZCH-4—2E8(簡稱2E8),是本院自行研制的鼠源性抗CD19單抗,本課題在前期研究的基礎上,對此單抗進行進一步的基因工程改造,構建可以表達人鼠嵌合型2E8抗體(Hm2E8b)的真核表達載體,轉染至CHO細胞

4、中表達,檢測Hm2E8b的生物學活性,為該抗體免疫毒素的研制和臨床應用以及進一步人源化改造打下基礎。
　　 方法:
　　 1.ZCH-4-2E8輕、重鏈信號肽和可變區(qū)基因克隆和序列分析。
　　 1)抽提2E8細胞RNA,并以此為模板,通過5’-RACE方法擴增出2E8單抗輕鏈和重鏈的可變區(qū)片段,建立TA克隆,送測序。
　　 2)將測序結果與2E8輕鏈和重鏈的已知序列進行比對,并通過SignalP3.0信號

5、肽預測服務軟件對2E8輕鏈和重鏈的信號肽進行預測。
　　 2.真核表達載體pHMCH3-Hm2E8b的構建。
　　 1)以pAc-κ-CH3載體為模板,設計引物PCR擴增出Fc片段,建立TA克隆,測序正確后,連入pcDNA3.1+載體,構建pHMCH3載體。
　　 2)通過重疊延伸PCR的方法擴增出scFv2E8片段,建立TA克隆,送測序,連入pHMCH3載體,構建真核表達載體pHMCH3-Hm2E8b。

6、　　 3.Hm2E8b融合蛋白的表達和活性檢測
　　 1)通過脂質體轉染的方法,以pHMCH3-Hm2E8b轉染CHO細胞,轉染后24小時G418加壓篩選。
　　 2)加壓篩選14天左右,RT-PCR,細胞免疫熒光,流式細胞儀分析法檢測陽性克隆。
　　 3)對陽性克隆進行單克隆化,流式細胞儀分析法篩選出高效穩(wěn)定表達細胞株,命名為CHO-Hm2E8b。
　　 4)收集上清,SPA Sepharose親和層

7、析法純化嵌合抗體Hm2E8b,BCA法測定抗體濃度。
　　 5)SDS-PAGE和Western-Blot檢測細胞培養(yǎng)上清中的重組蛋白Hm2E8b的表達,并確定分子量大小。
　　 6)滴定實驗和競爭結合實驗了解嵌合抗體Hm2E8b的親和力。
　　 7)CDC實驗檢測嵌合抗體Hm2E8b能否激活補體殺傷靶細胞。
　　 結果:
　　 1.ZCH-4-2E8輕、重鏈信號肽和可變區(qū)基因克隆和序列分析:經(jīng)S

8、ignalP3.0信號肽預測服務軟件分析,2E8輕鏈信號肽全長60bp,編碼20個氨基酸,2E8重鏈信號肽全長57bp,編碼19個氨基酸?？勺儏^(qū)序列與通用引物測序序列比較發(fā)現(xiàn)VL2E8序列有3處有差異,分別是3bp(T-C)、18bp(G—A)、19bp(A-T),VH2E8有5處存在差異,分別是1bp(G—C)、4bp(G-A)、6bp(G-C)、7bp(A—C)、13bp(G-C)。
　　 2.真核表達載體pHMCH3-Hm

9、2E8b的構建:通過PCR擴增人IgG1的Fc片段,將其插入真核表達載體pCDNA3.1+,構建pHMCH3載體。通過SOE-PCR擴增scFv2E8片段,將其插入pHMCH3載體,構建真核表達載體pHMCH3-Hm2E8b。
　　 3.Hm2E8b嵌合抗體的表達和功能的初步研究:以重組載體pHMCH3-Hm2E8b轉染CHO細胞,G418加壓培養(yǎng)2周獲得能表達Hm2E8b抗體蛋白的CHO細胞。RT-PCR檢測轉染的CHO細胞c

10、DNA可擴增出目的條帶,細胞免疫熒光法檢查可見轉染的CHO細胞內(nèi)含有目的蛋白。流式細胞儀分析法在轉染CHO細胞培養(yǎng)上清中檢測到有活性的人鼠嵌合型CD19抗體Hm2E8b,陽性細胞率為93.32％,且嵌合型抗體Hm2E8b對其親本抗體2E8-FITC有明顯的阻滯作用。對陽性細胞進行單克隆化,流式分析法篩選出高效穩(wěn)定表達株CHO-Hm2E8b,該細胞株G418加壓培養(yǎng)3-4周后陽性細胞數(shù)可達96％以上。SPA Sepharose親和層析法純

11、化Hm2E8b抗體,BCA法測濃度濃縮純化抗體為2mg／ml,CHO-Hm2E8b細胞培養(yǎng)上清濃度約為15μg／ml。SDS-PAGE和Western—Blot鑒定Hm2E8b抗體單體分子量約50KDa,上清中還存在130KDa和200KDa大小的多聚體。CDC實驗發(fā)現(xiàn)Hm2E8b能夠靶向殺傷CD19陽性的細胞Nalm6,該作用存在劑量依賴性。
　　 結論:
　　 成功研制了有活性的抗人CD19人鼠嵌合型抗體Hm2E8b