抗人CD40人-鼠嵌合抗體的構建表達及功能的初步研究.pdf

1、本研究在自行成功研制的鼠抗人CD40激發(fā)型單克隆抗體（5C11）和鼠抗人muCD40單克隆抗體（5H6）的基礎上，采用嵌合抗體構建方法，在真核細胞293T中實現表達，通過計算機輔助設計方法提高嵌合抗體表達量，并對嵌合抗體生物學功能進行初步研究。
　　 第一部分：CD40人-鼠嵌合抗體的構建、表達及功能初步研究
　　 從5C11雜交瘤細胞中抽取總RNA，常規(guī)逆轉錄，應用簡并引物進行PCR擴增，釣取重鏈Fd及輕鏈基因。根據重

2、、輕鏈基因序列設計引物，應用PCR方法擴增VH和VL基因。雙酶切裝載有信號肽序列及人IgGlγ-鏈的Fc、CH1基因的重鏈表達載體pCMV-VH以及裝載有信號肽序列及κ鏈的Cκ基因的輕鏈表達載體pCMV-VL。將同樣雙酶切的VH和VL基因連接入表達載體，構建成嵌合抗體（ch5C11）的輕鏈真核表達載體5C11L-pCMV及重鏈真核表達載體5C11H-pCMV。將嵌合抗體的輕重鏈真核表達載體共轉染入293T細胞，利用夾心ELISA法測定上

3、清中c5C11的濃度，利用流式細胞術檢測c5C11與膜抗原的特異性結合。選擇天然高表達CD40分子的人B淋巴瘤細胞株Daudi（陽性表達率>90％）與ch5C11共培養(yǎng)，鏡下觀察細胞生長形態(tài)，CCK-8分析ch5C11對Daudi細胞的生長與存活的影響。研究結果表明：成功構建了分別含嵌合重、輕鏈基因的真核表達載體5C11H-pCMV及5C11L-pCMV，并在293T細胞中得到瞬時表達。ch5C11能夠有效識別Daudi細胞膜型CD40

4、分子。ch5C11能有效抑制Daudi細胞體外增殖。提示CD40嵌合抗體具有良好的生物學活性。
　　 通過計算機輔助設計方法對c5C11的氨基酸序列進行改造，分析并設計突變影響嵌合抗體表達量的氨基酸。將改造后的輕鏈表達載體5C11L-pCMV及重鏈表達載體5C11H（M）-pCMV共轉染的293T細胞。利用夾心ELISA法測定上清中ch5C11的濃度，利用流式細胞術檢測ch5C11與膜抗原的特異性結合。選擇天然高表達CD40分子

5、的人B淋巴瘤細胞株Daudi（陽性表達率>90％）與ch5C11（M）共培養(yǎng)，鏡下觀察細胞生長形態(tài)，CCK-8分析ch5C11（M）對Daudi細胞的生長與存活的影響。結果表明：ch5C11（M）表達量有較顯著的提高。ch5C11（M）能夠有效識別Daudi細胞膜型CD40分子。ch5C11能有效抑制Daudi細胞體外增殖。提示CD40嵌合抗體具有良好的生物學活性。
　　 第二部分：muCD40人-鼠嵌合抗體的構建、表達及功能初

6、步研究
　　 從5H6雜交瘤細胞中抽取總RNA，常規(guī)逆轉錄，應用簡并引物進行PCR擴增，釣取重鏈Fd及輕鏈基因。根據重、輕鏈基因序列設計引物，應用PCR方法擴增VH和VL基因。雙酶切裝載有信號肽序列及人IgGlγ鏈的Fc、CH1基因的重鏈表達載體pCMV-VH以及裝載有信號肽序列及κ鏈的Cκ基因的輕鏈表達載體pCMV-VL。將同樣雙酶切的VH和VL基因連接入表達載體，構建成嵌合抗體（ch5H6）的輕鏈真核表達載體5H6L-pCM

7、V及重鏈真核表達載體5H6H-pCMV。將嵌合抗體的輕重鏈真核表達載體共轉染入293T細胞，利用夾心ELISA法測定上清中ch5H6的濃度，利用流式細胞術檢測ch5H6與膜抗原的特異性結合。
　　 綜上所述：1、成功構建了抗人CD40人-鼠嵌合抗體（ch5C11）。2、CD40嵌合抗體可有效抑制天然高表達CD40分子的人B淋巴瘤細胞株Daudi的體外增殖。3、通過計算機輔助設計方法對ch5C11的氨基酸序列進行改造后，瞬時表達量