抗CD133人源性單克隆抗體的篩選、鑒定及表達(dá).pdf

1、CD133蛋白(prominin-1)屬于五次跨膜蛋白—prominin家族，是該家族首個(gè)被鑒定的成員。Prominin家族蛋白的功能及其相應(yīng)配體至今尚不清楚。目前已有大量研究表明CD133是多種人體腫瘤干細(xì)胞表面標(biāo)志分子之一。CD133分子已經(jīng)在人類多種惡性腫瘤中用于分離和富集細(xì)胞亞群，該細(xì)胞群體能在體外形成克隆，并能在動(dòng)物體內(nèi)形成腫瘤。最近研究表明CD133分子是有價(jià)值的細(xì)胞表面標(biāo)志分子，有希望成為新治療策略中的靶標(biāo)。目前已有針對(duì)C

2、D133分子的鼠源性單克隆抗體，但由于其鼠源性會(huì)產(chǎn)生人抗鼠抗體(HAMA)，并且完整單抗分子過(guò)大難以進(jìn)入腫瘤組織內(nèi)，使其體內(nèi)診斷及治療受到了限制。因此，制備高特異性抗CD133的人源性單克隆抗體有重要意義。
　　 本研究通過(guò)原核表達(dá)并純化CD133分子第二胞外片段(loop1)和第三胞外片段(loop2)蛋白。純化后的CD133-loop1-HIS和CD133-loop2-HIS蛋白經(jīng)間接ELISA檢測(cè)顯示與鼠源抗CD133抗體

3、發(fā)生特異性結(jié)合。以純化后的CD133-loop1-HIS和CD133-loop2-HIS蛋白作為靶分子，篩選Tomlinson I+J文庫(kù)，獲得人源性scFv噬菌體抗體。在篩選抗體庫(kù)過(guò)程中，噬菌體種類、固相介質(zhì)表面抗原密度或溶液中抗原濃度和清洗時(shí)間三個(gè)因素對(duì)篩選效率影響最大。因本次使用的scFv抗體庫(kù)為無(wú)偏性的天然文庫(kù)，所以采用了五輪篩選，前兩輪采用中等的嚴(yán)密度，避免高親和力但低表達(dá)的噬菌體抗體克隆丟失。后三輪的嚴(yán)格篩選達(dá)到了篩選目的。

4、第五輪噬菌體的投入產(chǎn)出率比第三輪增加了42.5倍。將五輪篩選獲得的多克隆噬菌體抗體均進(jìn)行ELISA檢測(cè)，發(fā)現(xiàn)五輪篩選的OD450nm吸光度值逐漸升高。以第五輪篩選后獲得的多克隆噬菌體抗體感染宿主菌XL1-blue，挑取其中的單個(gè)菌落，制備出101株單克隆噬菌體抗體，用ELISA測(cè)定其抗原結(jié)合活性，以P/N值＞2.1為陽(yáng)性克隆，共計(jì)挑選87個(gè)陽(yáng)性克隆，陽(yáng)性率為86.1％。挑取其中6個(gè)P/N值＞8的陽(yáng)性克隆做進(jìn)一步研究。
　　 以挑

5、取的6株單克隆噬菌體抗體感染大腸桿菌XL1-Blue，擴(kuò)增后提取噬菌粒，構(gòu)建可溶性scFv表達(dá)載體，轉(zhuǎn)化大腸桿菌BL21(DE3)，經(jīng)1mM IPTG誘導(dǎo)后收集菌體周質(zhì)和包涵體蛋白。ELISA檢測(cè)證實(shí)有1個(gè)克隆成功地表達(dá)了可溶性的scFv抗體蛋白，可溶性抗體與人CD133蛋白有特異結(jié)合活性。純化后的scFv-1能夠與鼠源CD133單抗發(fā)生相互競(jìng)爭(zhēng)及抑制作用，說(shuō)明其識(shí)別并結(jié)合的抗原表位一致或有一定程度的相互重疊。通過(guò)對(duì)克隆1的可變區(qū)進(jìn)行序

6、列測(cè)定分析與NCBI-BLAST檢索，證實(shí)其與人免疫球蛋白IgG重鏈VH3氨基酸同源性為93％，差異主要集中在CDR2、CDR3區(qū)，輕鏈V區(qū)與人免疫球蛋白Vκ1氨基酸同源性為97％， CDR1、CDR2、CDR3區(qū)均存在氨基酸差異。根據(jù)同一家族中核苷酸序列同源性大于80％，說(shuō)明所獲抗體基因重鏈屬于人抗體VH3家族，輕鏈屬于人抗體Vκ家族。
　　 本研究以噬菌體展示技術(shù)得到了人源性抗CD133的單克隆抗體并初步探索了該抗體的部分生