抗人CD133-2單克隆抗體的研制及CD133-2分子在腫瘤細(xì)胞中的表達(dá)及其臨床意義.pdf

1、CD133(prominin—1)是一種局限性分布于胞漿膜的突出處，如上皮微絨毛、附睪導(dǎo)管上皮的硬纖毛處的糖蛋白，因此根據(jù)拉丁文prominere，取名為prominin．1997年，Yin等首次報(bào)道了一個(gè)新的造血干/祖細(xì)胞(HSPC)表面抗原AC133并制備了該抗原的單克隆抗體，2000年6月由國(guó)際白細(xì)胞分化抗原工作組會(huì)議(ILDAW)命名為CD133℃D133分子在蛋白結(jié)構(gòu)上不同于4次跨膜(4—TM)和7次跨膜(7—TM)受體家族成

2、員，它是5次跨膜(5—TM)受體家族中的第一個(gè)成員，分子量約為120kDa，其分子轉(zhuǎn)錄由5個(gè)不同的啟動(dòng)子控制。CD133分子具有胞外的氨基末端和胞內(nèi)的羧基末端，以及胞外的8個(gè)一樣的N—糖基化位點(diǎn)。CD133的分子結(jié)構(gòu)和蛋白表達(dá)的特點(diǎn)提示它可能是作為生長(zhǎng)因子受體發(fā)揮生物學(xué)作用。此外，有12個(gè)不同氨基酸序列的prominin—1剪接體相繼在嚙齒類和靈長(zhǎng)類被發(fā)現(xiàn)。
　　 CD133分子在干/祖細(xì)胞表達(dá)并隨細(xì)胞分化快速下調(diào)，該特點(diǎn)使之成

3、為內(nèi)皮、腦、骨髓、肝臟、腎臟、前列腺、胰腺和包皮等組織檢測(cè)和分離干/祖細(xì)胞的標(biāo)記分子。此外，除了在正常組織表達(dá)外，在白血病細(xì)胞、腦膠質(zhì)瘤、結(jié)腸癌、前列腺癌、肝癌和胰腺癌中也能檢測(cè)到CD133分子的表達(dá)。已有的研究結(jié)果表明CD133+腫瘤細(xì)胞具有很強(qiáng)的自我更新、增殖能力強(qiáng)和多向分化的潛能，提示CD133是研究腫瘤干細(xì)胞的重要靶分子之一。同時(shí)還有研究顯示CD133分子可能在腫瘤免疫逃逸、藥物耐受以及放療抵抗中發(fā)揮了重要作用。人CD133有2

4、種亞型，繼Yin克隆并鑒定了CD133—1后Yu等克隆出CD133—2，并發(fā)現(xiàn)與CD133—1僅在胎腦和骨骼肌中呈優(yōu)勢(shì)表達(dá)特性不同，CD133—2在許多胎兒組織和成熟組織中呈優(yōu)勢(shì)性表達(dá)，并在一些肺癌、前列腺癌、結(jié)腸癌和乳腺癌細(xì)胞株中也有表達(dá)。兩種異構(gòu)體的表達(dá)譜不同，它們的功能是否有差異目前尚不清楚。
　　 雖然，自CD133分子發(fā)現(xiàn)后的10多年來(lái)一直為廣大科研工作者所關(guān)注，但研究CD133分子的手段尚缺乏，特別是與其相互作用的分

5、子尚未克隆，CD133的生物學(xué)功能及參與的信號(hào)通路至今尚不清楚。目前使用的商品化抗CD133抗體(293C3，AC133，AC141，MiltenyiBiotec)在運(yùn)用中存在一定的局限性(主要針對(duì)該分子的糖基化位點(diǎn)，故糖基化水平的變化影響直接影響了CD133檢測(cè)到的表達(dá)水平)。因此，研制抗人CD133功能性單克隆抗體將有助于揭示CD133的生物學(xué)功能，研究該分子在腫瘤發(fā)生、發(fā)展中作用機(jī)制，也為腫瘤干細(xì)胞的研究提供了一種新的手段。

6、>　　 本論文旨在通過(guò)克隆人CD133—2全長(zhǎng)基因構(gòu)建穩(wěn)定表達(dá)CD133—2的L929轉(zhuǎn)基因細(xì)胞，研制鼠抗人CD133—2單克隆抗體，并對(duì)其生物學(xué)特性進(jìn)行初步研究；同時(shí)初步探討CD133—2分子在肺癌中的表達(dá)及其臨床意義。
　　 第一部分人CD133—2基因轉(zhuǎn)染細(xì)胞株的構(gòu)建以及生物學(xué)功能的初步研究
　　 [目的]克隆人CD133—2基因編碼區(qū)全長(zhǎng)基因，構(gòu)建重組真核表達(dá)載體pIRES2—EGFP—CD133—2，獲得穩(wěn)定

7、表達(dá)CD133—2基因的轉(zhuǎn)基因細(xì)胞并初步研究其對(duì)T細(xì)胞的體外生物學(xué)作用。
　　 [方法]通過(guò)重疊PCR從人胎肝cDNA文庫(kù)中擴(kuò)增出CD133—2的全長(zhǎng)編碼區(qū)cDNA，并克隆入pMDT—18載體中，雙酶切后裝入真核表達(dá)載體pIRES2—EGFP中，通過(guò)脂質(zhì)體法轉(zhuǎn)染L929細(xì)胞，經(jīng)G418抗性篩選出穩(wěn)定表達(dá)CD133—2分子的L929細(xì)胞株；采用RT—PCR、Western—blot和流式細(xì)胞儀等分析鑒定CD133—2分子的表達(dá)；采

8、用MTT、流式細(xì)胞術(shù)和ELISA等初步觀察CD133—2基因轉(zhuǎn)染細(xì)胞對(duì)T細(xì)胞體外生物學(xué)功能的影響。
　　 [結(jié)果]成功克隆出CD133—2全長(zhǎng)編碼區(qū)基因，構(gòu)建了含人CD133—2基因的重組真核表達(dá)載體，并獲得能穩(wěn)定高表達(dá)人CD133—2分子的L929轉(zhuǎn)基因細(xì)胞，初步功能學(xué)研究結(jié)果提示，CD133—2轉(zhuǎn)基因細(xì)胞可能具有體外抑制T細(xì)胞增殖的作用。
　　 [結(jié)論]成功建立了可穩(wěn)定高表達(dá)人CD133—2膜型分子的基因轉(zhuǎn)染細(xì)胞，為

9、研制抗人CD133—2單克隆抗體提供了有效的免疫原，也為進(jìn)一步研究CD133—2分子生物學(xué)功能提供了有價(jià)值的工具。
　　 第二部分鼠抗人CD133—2單克隆抗體的研制及其生物學(xué)特性的研究
　　 [目的]研制鼠抗人CD133—2單克隆抗體，分析人CD133—2分子在腫瘤細(xì)胞上的表達(dá)，并對(duì)其生物學(xué)特性進(jìn)行初步探討。觀察單克隆抗體對(duì)CD133—2表達(dá)的腫瘤細(xì)胞系U937和SW480的體外生物學(xué)作用，為抗體用于腫瘤干細(xì)胞研究提供

10、必備的物質(zhì)手段和實(shí)驗(yàn)依據(jù)。
　　 [方法]以高表達(dá)人CD133—2分子的基因轉(zhuǎn)染細(xì)胞L929/CD133—2為免疫原，常規(guī)免疫BALB/c小鼠，采用B淋巴細(xì)胞雜交瘤技術(shù)，將免疫小鼠脾臟細(xì)胞和骨髓瘤細(xì)胞株SP2/0融合，以CD133—2的基因轉(zhuǎn)染細(xì)胞和表達(dá)CD133—2的視網(wǎng)膜母細(xì)胞瘤細(xì)胞株WERI—Rb1和Y79為抗原篩選陽(yáng)性細(xì)胞，L929/mock細(xì)胞為抗原陰性篩選細(xì)胞；經(jīng)間接免疫熒光標(biāo)記和流式細(xì)胞術(shù)分析、反復(fù)篩選和多次克隆化

11、培養(yǎng)，獲得2株特異分泌鼠抗人CD133—2分子單克隆抗體的雜交瘤細(xì)胞株：采用細(xì)胞核染色體計(jì)數(shù)、Ig亞型快速定性試紙法、競(jìng)爭(zhēng)結(jié)合抑制以及Westernblot等試驗(yàn)，對(duì)獲得的雜交瘤細(xì)胞株及單克隆抗體進(jìn)行生物學(xué)特性的鑒定；用間接免疫熒光法初步分析單抗對(duì)不同來(lái)源人腫瘤細(xì)胞株的結(jié)合反應(yīng)；免疫組織化學(xué)方法分析胚胎組織和胎盤組織中CD133—2分子的表達(dá)；觀察CD133單克隆抗體對(duì)髓性白血病細(xì)胞株U937和結(jié)腸癌細(xì)胞株SW480的體外生物學(xué)效應(yīng)，包

12、括：苔盼藍(lán)活細(xì)胞計(jì)數(shù)、CCK8、集落形成實(shí)驗(yàn)分析U937細(xì)胞的增值；PI染色和流式細(xì)胞術(shù)分析細(xì)胞周期分布。
　　 [結(jié)果]成功獲得2株持續(xù)、穩(wěn)定分泌鼠抗人CD133—2單克隆抗體的雜交瘤細(xì)胞株，分別命名為6B3和9G4。經(jīng)過(guò)快速定性試紙分析顯示，2株單抗輕鏈均為κ鏈，重鏈均為IgG2b亞類；Westernblot結(jié)果顯示6B3和9G4均能和CD133—2/L929和WERI—Rb1細(xì)胞的蛋白結(jié)合，特異性識(shí)別和結(jié)合約120kDa的

13、蛋白；免疫組織化學(xué)試驗(yàn)顯示6B3能特異性結(jié)合6周胚胎的大腦皮層組織、肝臟組織和腎臟組織。在胎盤組織的絨毛上皮細(xì)胞中亦有表達(dá)。競(jìng)爭(zhēng)結(jié)合抑制實(shí)驗(yàn)顯示2株抗體間不產(chǎn)生競(jìng)爭(zhēng)作用。對(duì)mAb生物學(xué)特性的研究結(jié)果表明，2株mAb均能識(shí)別U937、THP—1、SW480、WERI—Rb1和Y79等腫瘤細(xì)胞株表面的CD133—2分子?；罴?xì)胞計(jì)數(shù)和CCK—8檢測(cè)顯示，單抗6B3可以促進(jìn)細(xì)胞株U937和SW480的體外增殖，并呈一定的劑量依賴性效應(yīng)。此外，單

14、抗6B3能增加U937細(xì)胞集落的形成，使U937細(xì)胞S期增加。單抗9G4沒(méi)有類似的作用。
　　 [結(jié)論]成功獲得2株穩(wěn)定分泌特異性鼠抗人CD133—2單抗的雜交瘤細(xì)胞株，其分泌的抗體與商品化抗人CD133—2單抗識(shí)別不同的抗原表位。免疫熒光標(biāo)記和流式細(xì)胞分析顯示，CD133—2分子在一些腫瘤細(xì)胞株表達(dá)。免疫組化分析表明CD133—2分子在胚胎組織和胎盤組織中有表達(dá)。單抗6B3可以促進(jìn)CD133—2表達(dá)的U937和SW480細(xì)胞株

15、在體外的增殖。由此表明，CD133—2分子不僅僅是細(xì)胞膜表面的一種標(biāo)記分子，它具有其特定的生物學(xué)功能。單抗6B3是一株激發(fā)型的抗人CD133—2的功能性抗體，該抗體的獲得為探討CD133—2分子的表達(dá)譜及CD133—2的生物學(xué)功能提供了有價(jià)值的研究工具。
　　 第三部分CD133—2在肺癌中的表達(dá)及其臨床意義
　　 [目的]研究非小細(xì)胞肺癌(NSCLC)組織中CD133—2分子的表達(dá)及其臨床意義。
　　 [方法]

16、通過(guò)免疫組織化學(xué)技術(shù)分析NSCLC組織103例、癌旁組織25例和肺部良性病變組織24例中CD133—2的表達(dá)，并結(jié)合臨床資料，采用病例對(duì)照設(shè)計(jì)統(tǒng)計(jì)分析CD133—2的表達(dá)與非小細(xì)胞肺癌患者臨床特征之間的關(guān)系。
　　 [結(jié)果]免疫組織化學(xué)結(jié)果顯示，NSCLC組織中CD133—2分子的表達(dá)與腫瘤細(xì)胞分化程度有關(guān)(P＜0.01)，與抑制性免疫調(diào)節(jié)分子B7—H4的表達(dá)存在一定相關(guān)性(P＜0.01)。COX險(xiǎn)分析顯示：?jiǎn)我蛩睾投嘁蛩胤治龆?/p>

17、顯示CD133—2是非小細(xì)胞肺癌患者長(zhǎng)期生存率的獨(dú)立風(fēng)險(xiǎn)因素(危險(xiǎn)系數(shù)4.202，P＜0.001)。
　　 [結(jié)論]本研究發(fā)現(xiàn)人非小細(xì)胞肺癌組織中有CD133—2的表達(dá)，并與肺癌細(xì)胞分化程度相關(guān)。此外，我們還發(fā)現(xiàn)肺癌組織中CD133—2的表達(dá)與抑制性協(xié)同刺激分子B7—H4的表達(dá)呈正相關(guān)。該研究為揭示CD133—2在肺癌發(fā)生、發(fā)展中的作用提供了新的線索。
　　 綜上所述，本課題通過(guò)克隆人CD133—2全長(zhǎng)基因，構(gòu)建基因轉(zhuǎn)染

18、細(xì)胞株L929/CD133—2；以L929/CD133—2為免疫原免疫小鼠研制獲得2株特異性鼠抗人CD133—2單克隆抗體6B3和9G4；進(jìn)一步對(duì)單抗的生物學(xué)特性進(jìn)行研究證實(shí)單抗6B3為激發(fā)型單抗，能在體外促進(jìn)CD133—2表達(dá)的細(xì)胞株U937和SW480的增殖。同時(shí)，通過(guò)免疫組織化學(xué)檢測(cè)了非小細(xì)胞肺癌組織中CD133—2分子的表達(dá)，并通過(guò)統(tǒng)計(jì)學(xué)分析了CD133—2表達(dá)與負(fù)性協(xié)同刺激分子B7—H4的表達(dá)及其與臨床資料的相關(guān)性，為腫瘤的免